[發明專利]一種檢測嘔吐毒素的試紙條及其應用

有效

• 申請號: 201310329001.6
• 申請日: 2013-07-31
• 公開（公告）號: CN104345145A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發明（設計）人: 馮才偉;扶勝;楊學林;賈芳芳;景瀅瀅;聶雯瑩;馮靜;孫震
• 申請（專利權）人: 北京勤邦生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/532
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種檢測嘔吐毒素的試紙條及其應用，具體涉及一種用于檢測嘔吐毒素的膠體金試紙條，其特別適用于谷物及飼料中嘔吐毒素殘留的檢測。

背景技術

嘔吐毒素(vomitoxin)?又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，是單端孢菌素烯烴中的一種，它通常是由生長在谷類物品（如小麥、玉米、大麥和秣草）霉菌鐮紅菌素生成的。嘔吐毒素的毒性效應包括：嘔吐、不想進食、胃腸炎、腹瀉、免疫抑制和血液病。

DON廣泛存在于全球，主要污染小麥、大麥、玉米等谷類作物，也污染糧食制品，人和動物在誤食被該毒素污染的糧谷類后可以產生廣泛的毒性效應。近年來發現DON可能與人類食管癌、IgA腎病有關，對人類及動物的健康構成威脅。人畜攝入了被DON污染的食物/飼料后，會導致厭食、嘔吐、腹瀉、發燒、站立不穩、反應遲鈍等急性中毒癥狀，嚴重時損害造血系統造成死亡。研究表明，DON可能對免疫系統有影響，有明顯胚胎毒性和一定致畸作用，可能有遺傳毒性，但無致癌、致突變作用。由于DON的危害嚴重，引起了各國的普遍重視。谷物及飼料中DON的含量有嚴格的限量標準。我國谷物、豬配合飼料、犢牛配合飼料、泌乳期動物配合飼料中DON?的限量標準為1.0?mg/kg?，牛配合飼料、家禽配合飼料中DON?的限量標準為5.0?mg/kg?。

目前檢測嘔吐毒素的方法有多種，如薄層色譜法、酶聯免疫吸附試驗(ELISA）、氣相色譜、高效液相色譜、紅外光譜分析等。其中，儀器法靈敏、準確，但需要昂貴的儀器、樣品的前處理復雜、繁瑣費時、檢測的成本較高，不能現場操作，而且需專業人員操作，所以限制了其應用。因此，針對現有嘔吐毒素檢測技術上的不足，我們設計了一種用膠體金免疫層析技術檢測谷物及飼料中嘔吐毒素的方法，該方法特異性好、靈敏度高、操作簡便、檢測成本低、適合于批量樣品的篩選檢測，是理想的快速篩選手段，能夠更好地滿足我國谷物及飼料企業、政府職能監管部門等開展檢測工作。

發明內容

本發明的目的是提供一種靈敏度高、操作簡單、成本低、檢測時間短的嘔吐毒素殘留檢測試紙條。

本發明所提供的檢測嘔吐毒素殘留的試紙條，包括樣品吸收墊（1）、結合物釋放墊（2）、反應膜（3）、吸水墊（4）和底板（7）；所述反應膜上具有包被有嘔吐毒素半抗原-載體蛋白偶聯物的檢測線（5）和包被有羊抗鼠抗抗體的質控線（6），所述結合物釋放墊（2）噴涂有嘔吐毒素單克隆抗體-膠體金標記物。

所述嘔吐毒素半抗原-載體蛋白偶聯物是由嘔吐毒素半抗原與載體蛋白偶聯得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。

所述嘔吐毒素單克隆抗體是以嘔吐毒素半抗原-載體蛋白偶聯物作為免疫原制備獲得，是由嘔吐毒素單克隆抗體雜交瘤細胞株分泌獲得；所述羊抗鼠抗抗體是將鼠源抗體免疫羊得到。

所述樣品吸收墊（1）、結合物釋放墊（2）、反應膜（3）、吸水墊（4）依次粘貼在底板（7）上，所述結合物釋放墊1/3~1/2被覆蓋于樣品吸收墊下。

所述底板可為PVC底板或其他硬質不吸水的材料；所述樣品吸收墊可為吸濾紙或濾油紙；所述結合物釋放墊可為玻璃棉或聚酯材料；所述吸水墊為吸水紙；所述反應膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜。

本發明的另一個目的是提供一種制備上述試紙條的方法，其包括步驟：

1）制備噴涂有嘔吐毒素單克隆抗體-膠體金標記物的結合物釋放墊；

2）制備具有包被有嘔吐毒素半抗原-載體蛋白偶聯物的檢測線和包被有羊抗鼠抗抗體的質控線的反應膜；

3）將1）和2）制備好的結合物釋放墊、反應膜與樣品吸收墊、吸水墊和底板組裝成試紙條。

具體地說，步驟包括：

1）半抗原制備：將嘔吐毒素與鄰苯二甲酸酐反應得到嘔吐毒素半抗原；

2）將嘔吐毒素半抗原與載體蛋白偶聯，得到嘔吐毒素半抗原-載體蛋白偶聯物；

3）用嘔吐毒素半抗原-載體蛋白偶聯物免疫小鼠，將小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞通過融合、篩選，得到嘔吐毒素單克隆雜交瘤細胞株；

4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗體；

5）用檸檬酸三鈉與氯金酸反應制備膠體金；

6）將步驟3）制備的嘔吐毒素單克隆抗體加入步驟5）制備的膠體金中，得到嘔吐毒素單克隆抗體-膠體金標記物；

7）將嘔吐毒素單克隆抗體-膠體金標記物噴涂在結合物釋放墊上，37℃烘1h后取出，置于干燥環境中保存備用；