[發明專利]鵝原代肝細胞SCD1基因沉默試劑盒及其應用

無效

• 申請號: 201310328544.6
• 申請日: 2013-07-31
• 公開（公告）號: CN103361352A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 龔道清;洪勝輝;張軍;張宜輝;張蕊;蔣拾貝;邵丹;王來娣;朱振鵬;宋政
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12Q1/68
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及鵝脂肪代謝中一個重要基因沉默的方法，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

硬脂酰輔酶A去飽和酶（Stearoyl-CoA?desaturease,SCD）是位于內質網上的一類催化酶，是肝細胞合成單不飽和脂肪酸的限速酶，能在脂肪酸C9位置引入不飽和雙鍵，催化飽和脂肪酸的脂酰輔酶A脫氫，其首選底物是軟脂酰（16:0）和硬脂酰輔酶A（18:0），分別轉化為棕櫚油（16:1）和油酸（18:1），這些不飽和脂肪酸是合成甘油三酯、磷脂、膽固醇、蠟酯的重要底物。由于不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例影響著膜磷脂、脂蛋白代謝和信號轉導，從而與糖尿病、動脈粥樣硬化、癌癥、肥胖癥等多種疾病相關，具有廣泛的生理生化作用，因此，SCD在近年成為研究熱點，被認為是用于分析代謝疾病的主要候選基因，研究發現,SCD主要有四種亞型：SCD1，SCD2，SCD3，SCD4，普遍存在于肝臟、腦、腎、肺、脂肪等組織中。鵝的SCD目前只發現了SCD1，長約1083bp，主要在肝臟中表達。鵝鴨等經過強飼可以形成可逆的脂肪肝，農業生產中利用鵝、鴨等這種特殊生理功能生產商業肥肝。國內外學者對此領域展開了廣泛研究，試圖了解肥肝形成機制，為加快肥肝生產提供技術上的支持。Ntambi（1992）研究發現飲食中碳水化合物較高的小鼠肝SCD1基因表達較豐富。Cohen和Ntambi等2005年證明SCD完全缺失的小鼠飼喂高脂飼糧不易形成肥胖，而且小鼠肝臟中不易沉積脂肪造成肝臟變性。這些研究說明SCD的表達與肥胖形成和胰島素抵抗有關。Herault等（2009）選擇與脂類代謝相關部分基因檢測其在填肥后北京鴨和Muscovy的肥肝中的表達發現填肥后參與脂肪酸合成的基因高表達，而且填肥后肝臟中脂肪酸合成和TG合成途徑旺盛。Herault等（2009）認為SCD1可能是甘油三酯合成脂肪肝負責的關鍵酶。肝癌細胞SCD1水平下調和基因敲除SCD1的小鼠都會導致甘油三酯分泌速率的降低。朱麗慧（2010）利用抑制性消減雜交技術篩選鵝肥肝中差異表達基因，結果發現填肥組肝臟中SCD1的表達水平顯著高于對照組，極有可能是影響肝臟脂肪代謝的主效基因。

鑒于SCD1在脂質代謝中，即在脂肪合成與脂肪酸氧化中，都發揮著舉足輕重的作用。SCD1的調控對維持正常生理狀態和體內脂質內環境穩定意義重大。靶向抑制SCD1的表達能使動物脂肪沉積減少，能量消耗增大，因而抑制SCD1的表達有可能成為脂質代謝異常（包括肥胖、高脂血癥、脂肪肝等）的有效治療方法。基因敲除是一種很有效的手段，但是基因敲除成本高，周期長，技術難度大，不是一般實驗室所能開展。RNA干擾技術近年來被廣泛應用于基因功能研究和疾病治療領域，它不需要高難度、復雜的實驗操作，不需要特殊的儀器設備，就能特異性的阻斷目的基因的表達，實現目標基因的沉默效應，從而研究基因的功能。

發明內容

本發明涉及一種鵝肝細胞脂肪代謝重要基因SCD1的沉默試劑盒及檢測方法。

本發明所述試劑盒包括（1）至（11）號試劑：

（1）SCD1基因的特異干擾雙鏈siRNA（5'→3'，GCCUUCCAGAAUGACAUCUTT（SEQ?ID?NO.1）；

AGAUGUCAUUCUGGAAGGCTT（SEQ?ID?NO.2），20μmol/L）

（2）脂質體2000（轉染試劑）

（3）無血清的OPti-MEM培養液

（4）反轉錄buffer

（5）反轉錄酶混合液

（6）Oligo?dT引物(50μmol/L)

（7）Random引物(100μmol/L)

（8）去RNA酶雙餾水

（9）熒光定量PCR特異引物（SCD1-F：5′-CACCTGGCTAGTGAACAG-3′（SEQ?ID?NO.3），

SCD1-R：5′-AACTCACTGGTGGAGTAGTC-3′（SEQ?ID?NO.4）

GAPDH-F：5′-GCCATCAATGATCCCTTCAT-3′（SEQ?ID?NO.5）

GAPDH-R：5′-CTGGGGTCACGCTCCTG-3′（SEQ?ID?NO.6），10μmol/L）

（10）高效熒光定量Taq酶混合液（2ⅹ）

（11）ROX?Reference?DyeⅡ(50ⅹ）。