[發明專利]一種報告基因重組在染色體目的基因上的方法、位點及用途

無效

• 申請號: 201310327687.5
• 申請日: 2013-07-31
• 公開（公告）號: CN103484496A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 趙營;翟德勝;武俊芳;宋向鳳;許重潔;趙德安;李嵩箕;谷爭;袁會峰;趙繁榮;王小引
• 申請（專利權）人: 新鄉醫學院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種報告基因插入染色體完整目的基因位點、構建方法和用途。?

背景技術

基因打靶技術（gene?targeting）是一項新興的分子生物學技術，是利用外源DNA與受體細胞染色體DNA上的同源序列之間發生重組，將外源DNA定點整合入受體細胞基因組上某一確定的位點?；虼虬屑夹g在研究基因的結構和功能、表達與調控、轉基因及基因治療等方面已經成為有力的工具。?

利用報告基因可有效地研究目的基因的表達調控。目前多數轉基因動物報告基因的表達是由目的基因啟動子驅動，可以研究目的基因啟動子的調控。由于基因增強子、位點控制區域（locus?control?region,?LCR）及絕緣子（insulators）等調控元件對于基因的表達和調控十分重要，但這些元件常常距基因有約50?kb之遙，而且目的基因所包含的天然內含子可能帶有影響mRNA剪接和調控蛋白表達的信號，目的基因所處的天然的染色體環境也是調控基因表達的重要因素。但目前，報告基因重組在“天然”染色體目的基因上的研究報道較少。因此，迫切需要建立報告基因重組在染色體目的基因上的報告基因轉基因動物，為目的基因的表達調控研究提供基本完全天然的染色體環境。因此，本發明確定了報告基因重組在染色體目的基因上的位點，利用基因打靶技術構建報告基因重組在目的基因上的報告基因轉基因動物，為在完全天然染色體背景下研究完整目的基因表達和調控建立了研究平臺。?

發明內容

本發明公開一種報告基因重組在染色體完整目的基因上的方法。?

也就是說，本發明目的是提供一種建立報告基因重組在染色體完整目的基因上的方法，確定報告基因插入目的基因的位點，利用基因打靶技術構建報告基因重組在目的基因上的報告基因轉基因動物，該位點報告基因的插入，為目的基因表達和調控研究提供了完全天然染色體環境。?

一種建立報告基因重組在染色體目的基因上的方法，其特征在于重組位點是目的基因的最后一個外顯子的終止密碼子后，把IRES-報告基因重組在目的基因的最后一個外顯子的終止密碼子后。?

重組后，目的基因和IRES-報告基因一起轉錄成融合的mRNA，目的基因mRNA各外顯子剪接正確。?

IRES-報告基因與目的基因融合的mRNA，分別翻譯成報告基因蛋白和目的基因蛋白。報告基因蛋白可以定時檢測。由于報告基因與目的基因一起轉錄成融合的mRNA，報告基因的表達能相對定量目的基因的表達。?

重組方法中的IRES，報告基因可以從市售報告基因質粒獲得。其中市售報告基因質?？梢允菬晒馑孛赶盗袌蟾婊蛸|粒，熒光蛋白系列報告基因質粒，分泌性堿性磷酸酶系列報告基因質粒。?

在建立轉基因動物前，需要先進行體外實驗，確定報告基因重組在染色體完整目的基因上的位點，考察此位點的重組，是否會引起目的基因?mRNA剪接錯誤，影響目的基因?mRNA完整性，以及報告基因能否反映目的基因表達調控。?

然而，目前由于完整目的基因為大片段DNA（>10?kb），在技術上，研究比較困難，長期限制了報告基因在完整目的基因的表達調控研究上的應用。細菌人工染色體（Bacterial?Artificial?Chromosome,?BAC）為目的基因研究提供了基本完整的染色體DNA背景。BAC同源重組，為報告基因與完整目的基因重組提供了簡便、可行的實驗工具。?

本發明通過BAC同源重組，選擇報告基因插入目的基因的位點，考察此位點的重組，是否會引起目的基因?mRNA剪接錯誤，影響目的基因?mRNA完整性，以及報告基因能否反映目的基因表達調控。體外實驗確定報告基因插入目的基因的位點后，構建報告基因重組在染色體原位目的基因上的報告基因轉基因動物，在整體水平，為在完全天然染色體背景下研究目的基因表達和調控提供了研究平臺。?

體外BAC同源重組基因工程方法基于3個λRed-encoded?基因?(Red,?recombination?deficient?mutant?of?phage?噬菌體重組缺陷型)?exo，bet?和gam介導的同源重組。Exo?編碼5’-3’核酸外切酶產生待插入雙鏈DNA3’懸端，bet編碼一對蛋白，該蛋白綁定在待插入雙鏈DNA3’懸端，并介導退火以及與BAC上互補DNA發生同源重組。Gam?編碼RecBCD核酸外切酶抑制蛋白，保護待重組的DNA不被RecBCD降解。Exo，bet和gam的表達由溫度敏感的抑制物控制，細菌在32℃培養時，這三個基因不表達。細菌42℃，15分鐘，exo，bet和gam被快速誘導至高表達水平，同源重組得以有效進行。?