[發(fā)明專(zhuān)利]豬肝臟特異性表達(dá)基因TTR啟動(dòng)子的克隆及應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310327149.6
• 申請(qǐng)日: 2013-07-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103421793A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣思文;周鵬
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/113
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/113;C12N15/85
• 代理公司: 武漢宇晨專(zhuān)利事務(wù)所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到豬骨骼肌特異性表達(dá)基因TTR啟動(dòng)子區(qū)域的分離鑒定及功能驗(yàn)證。

背景技術(shù)

高等生物基因的表達(dá)受到細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的精細(xì)調(diào)控，因而具有嚴(yán)格的時(shí)間及空間有序性。基因的表達(dá)調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜且有序的過(guò)程，由多階段調(diào)控水平共同完成，這主要包括轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、翻譯后五個(gè)水平。其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄水平上一個(gè)重要的調(diào)控元件，是位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游區(qū)的DNA序列，可與眾多的轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)控基因的表達(dá)(武力1999)。因此深入研究啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)、功能、作用模式等有利于我們更好的理解相應(yīng)基因的功能及基因間的互作關(guān)系。

啟動(dòng)子分類(lèi)方法較多，根據(jù)啟動(dòng)子的功能及作用方式可以分為組成型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；根據(jù)啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)及位置可以分為核心啟動(dòng)子、近端啟動(dòng)子及遠(yuǎn)端啟動(dòng)子（Wang?and?Hannenhalli2006;Reddy?et?al2003;Aneja?et?al2008）；根據(jù)核心啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)又可以分為集中型啟動(dòng)子和分散型啟動(dòng)子。盡管啟動(dòng)子的分類(lèi)多種多樣，對(duì)于真核生物而言，RNA聚合酶II型啟動(dòng)子起著主要作用（Sandelin?et?al2007）。在組織特異性啟動(dòng)子調(diào)控的基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達(dá)，并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特征。具備高轉(zhuǎn)錄活性的組織特異性啟動(dòng)子是基因工程中的理想啟動(dòng)子，這類(lèi)啟動(dòng)子既能高效啟動(dòng)外源基因表達(dá)，又能使外源基因在特定的靶細(xì)胞或靶組織中表達(dá)，這比現(xiàn)階段廣泛利用的CMV和SV40啟動(dòng)子更具有研究和實(shí)用價(jià)值。

組織特異性啟動(dòng)子通常以特定的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)、物理信號(hào)為基礎(chǔ)，可對(duì)外源基因進(jìn)行靶向定位，將基因固定于某一組織或細(xì)胞中表達(dá)，減少了機(jī)體能量和物質(zhì)的損耗及對(duì)機(jī)體代謝活動(dòng)的影響，同時(shí)又能夠起到定向改善某一組織特性的效果，這在人類(lèi)疾病治療方面的前景尤其可觀。其次，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種研究中，通過(guò)組織特異性啟動(dòng)子調(diào)控外源目的基因在靶組織中表達(dá)，能夠有效改善動(dòng)物的某些性狀，如肌內(nèi)脂肪；或改善動(dòng)物的消化系統(tǒng)以減少排泄物中的氮磷含量等。鑒于此，組織特異性啟動(dòng)子在基因工程和轉(zhuǎn)基因育種中越來(lái)越受到研究者的青睞。

TTR基因，翻譯為甲狀腺素運(yùn)載蛋白(transthyretin，TTR)又稱(chēng)為前白蛋白(prealbumin，PA)，VA運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白，分子質(zhì)量約為54ku，主要由肝細(xì)胞合成(Zeledon?et?al2006)，甲狀腺素運(yùn)載蛋白90％是由肝臟產(chǎn)生，而后分泌到人腦脊液和血液(Chen?et?al2005)，脈絡(luò)膜叢及視網(wǎng)膜也產(chǎn)生此蛋白質(zhì)的小片段。

到目前為止，未見(jiàn)到研究豬肝臟肌特異性表達(dá)基因TTR的啟動(dòng)子功能的相關(guān)報(bào)道。所以申請(qǐng)人對(duì)這個(gè)基因進(jìn)行了啟動(dòng)子的功能研究，以期能夠更好地利用該啟動(dòng)子。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于分離克隆豬的肝臟特異性表達(dá)基因TTR啟動(dòng)子區(qū)域，并對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證,以期獲得此基因的具備較高啟動(dòng)活性并保持肌肉組織特異性的調(diào)控序列，為動(dòng)物基因工程提供可利用的組織特異性啟動(dòng)子。

本發(fā)明從大白豬的基因組中分離并鑒定出TTR基因具有肝臟組織特異性的啟動(dòng)子。以大白豬的血液基因組DNA為模板擴(kuò)增獲得了2185bp長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段，將該片段融合報(bào)告基因螢火蟲(chóng)熒光素酶基因（簡(jiǎn)稱(chēng)LUC基因）構(gòu)建pGL3-TTR-pro真核表達(dá)載體，將這些載體分別轉(zhuǎn)染C2C12、3T3-L1及Hepa1-6細(xì)胞，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析報(bào)告基因螢火蟲(chóng)熒光素酶的相對(duì)活性，從而獲得保持肝臟組織特異性的啟動(dòng)子區(qū)，進(jìn)一步構(gòu)建該啟動(dòng)子與BGL1基因的重組載體，BGL1基因來(lái)自于扣囊復(fù)膜孢酵母(Saccharomycopsis?fibuligera)的基因組，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)BGL1的表達(dá)量。

具體地，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明的技術(shù)路線見(jiàn)圖1所示。