[發明專利]CDKL1基因及其siRNA和應用

在審

• 申請號: 201310326922.7
• 申請日: 2013-07-30
• 公開（公告）號: CN104342440A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發明（設計）人: 劉穎斌;談竹君;李茂嵐;吳向嵩;翁昊;束翌俊;包潤發;丁倩;曹陽
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬新華醫院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/63;C12N15/867;A61K48/00;A61P35/00;C12Q1/04;C12Q1/68;C12N5/10
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 朱水平;沈利

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種CDKL1基因的小分子干擾核糖核酸標靶DNA，抑制CDKL1基因表達的siRNA的核苷酸序列、編碼所述siRNA的重組載體及其在制備和篩選抗癌的藥物中的用途。

背景技術

膽囊癌是膽道系統中最常見的惡性腫瘤，占消化系統惡性腫瘤的第五位，早期膽囊癌無特異性的臨床表現，大多數患者發現時已處于進展期，進展期膽囊癌手術后的預后很差，5年存活率僅為5%。導致膽囊癌患者術后生存期短的主要原因在于術后的復發和轉移。目前臨床上沒有可以用于判斷膽囊癌患者術后轉移的分子靶標，也沒有可以用于治療腫瘤細胞轉移的潛在的靶向藥物治療靶點。

CDKL1(cyclin-dependent?kinase-like1(CDC2-related?kinase))是細胞周期蛋白依賴性激酶樣蛋白1。該蛋白最早在1992年被報道，Meyerson等設計了針對cdc2蛋白的保守序列的簡并引物，通過PCR的方法，從cDNA文庫中鑒定出7個新的cdc2相關激酶（cdc2related?kinase）。其中一個被稱為KKIALRE的分子后來被命名為CDKL1(M?Meyerson,GH?Enders,CL?Wu,LK?Su,C?Gorka,C?Nelson,E?Harlow,LH?Tsai:A?family?of?human?cdc2-related?protein?kinases.EMBO?J1992,11:2909-17)。

關于CDKL1分子的功能，目前了解地非常少。已有報道Cdc2在細胞周期中，調控細胞進入S期(M?Pacek,TA?Prokhorova,JC?Walter:Cdk1:unsung?hero?of?S?phase?Cell?Cycle2004,3:401-3)，盡管和cdc2的結構具有較高的相似性，但是到目前為止CDKL1是否參與細胞周期調控仍然未知。通過對CDKL1結構的分析，CDKL1含有一個保守的MAP激酶雙磷酸化結構域（MAP?kinase?dual?phosphorylation?motif）。該分子可以被表皮生長因子（epidermal?growth?factor，EGF）激活且整個過程不需要磷酸化。另外，通過對于腦內CDKL1的免疫組化實驗研究，發現該分子主要是一個分布在膠質內的蛋白，它的主要功能可能是影響膠質細胞生成(SH?Yen,A?Kenessey,SC?Lee,DW?Dickson:The?distribution?and?biochemical?properties?of?a?Cdc2-related?kinase,KKIALRE,in?normal?and?Alzheimer?brains.J?Neurochem1995,65:2577-84)。

RNA干擾現象（RNA?interference，RNAi）是細胞內自主產生的生物進化過程中一項保守的防御機制。siRNA被認為是RNA干擾的主要效應物，已成為一種通過抑制目的基因的表達來研究哺乳動物基因功能的有效工具。直接轉染合成的siRNA能特異性抑制動物細胞內同源基因的表達，但是細胞內siRNA很容易降解，因此這種方法不能實現穩定的RNA干擾。慢病毒載體在動物細胞內感染效率高，免疫原性低，且既能感染分裂期的細胞又能感染非分裂期的細胞。由于病毒載體的這些特性，慢病毒介導RNA干擾能在各類動物細胞內長期穩定地表達siRNA，抑制基因表達，因此該方法具有高效、穩定、特異性強、適用范圍廣的特定，已成為RNA干擾技術的主要研究工具。RNA干擾技術在生物醫藥上的應用為臨床腫瘤的應用基礎研究增加了強有力的手段。

發明內容

因此，本發明要解決的技術問題就是針對目前臨床上腫瘤病人的預后很差，手術后生存期很短，同時缺乏有效的預測腫瘤原發耐藥的分子診斷標記物和治療腫瘤原發耐藥的分子靶點的問題，提供一種有效抑制CDKL1基因表達的siRNA分子，所述siRNA分子作用的標靶DNA及其在制備或篩選抗腫瘤藥物中的應用。

本發明解決上述技術問題采取的技術方案之一是：一種分離的CDKL1基因小分子干擾核糖核酸標靶DNA，其中所述標靶DNA是：

（1）CDKL1編碼基因上的連續15～27個核苷酸組成的DNA；

（2）序列如SEQ?ID?NO:1，SEQ?ID?NO:2，SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:4中任意一條所示的DNA；或

（3）與（1）或（2）所述的DNA在嚴緊雜交條件下雜交的多核苷酸組成的DNA，或者與其互補的DNA。