[發明專利]一種檢測特異性重組人胰島素大腸桿菌殘留宿主蛋白的方法

有效

• 申請號: 201310326398.3
• 申請日: 2013-07-30
• 公開（公告）號: CN103439512A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 冷春生
• 申請（專利權）人: 通化東寶藥業股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 北京遞進知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11414
• 代理人: 田豐

技術領域

本發明涉及基因重組人胰島素大腸桿菌殘留宿主蛋白的檢測方法，特別是用于檢測通化東寶藥業股份有限公司生產的工藝特異性的重組人胰島素的大腸桿菌殘留宿主蛋白含量。

背景技術

重組人胰島素（recombinant?human?insulin,以下簡稱RHI）自1982年美國FDA批準上市以來，便在全球范圍內廣泛應用于II型糖尿病的臨床治療。RHI通常是利用大腸桿菌工程菌來制備，正如其它重組蛋白一樣，宿主蛋白在產品中有殘留幾乎是不可避免的，從而對產品造成污染。這些殘留宿主蛋白在血液中的累計濃度達到100ppm時，很可能會刺激人的免疫系統引起免疫反應，從而影響藥物的療效。

目前臨床應用的RHI產品是由多個不同廠家生產的，而不同廠家的生產工藝不盡相同，例如，我單位（通化東寶藥業股份有限公司）采用整合了人胰島素基因的pZRHi-1質粒的大腸桿菌進行發酵生產RHI（甘舒霖牌重組人胰島素），該工藝具有發酵時間短、適合大批量生產、產品純化過程簡單及生產成本低等優點。不同廠家制備工藝上的差異造成RHI產品中殘留宿主蛋白構成的不同。但當前用于RHI產品大腸桿菌殘留宿主蛋白檢測的通常是ELISA試劑盒，該試劑盒在制備抗體時所采用的抗原是普通大腸桿菌，所以在檢測特異工藝RHI產品的殘留宿主蛋白時，特異性低，靈敏度差，測定結果不能真實地反應出產品中殘留宿主蛋白的含量，即便檢測結果顯示合格，也不能充分說明其安全。另外，截止目前，普通測定方法（如，高效液相法等）都不適用于具有工藝特異性的RHI中殘留宿主蛋白的檢測。

因此，提供一種靈敏度高、特異性強且重復性好的特異性重組人胰島素大腸桿菌殘留宿主蛋白的檢測方法，以便準確地測出殘留宿主蛋白含量尤為重要，不但可以保證生物制品的安全性，也可作為生產過程中質量控制和工藝優化的重要參數。

我單位自1998年開始上市銷售甘舒霖牌重組人胰島素，填補了國內空白，目前已在臨床上廣泛應用，每年銷售額10億以上。隨著生物藥的發展和人們對該類藥物的了解，生物藥的安全問題越來越引起人們的重視。我單位以為病患提供更為安全、有效的藥品為宗旨，因此，發明人針對我單位RHI產品的特異性工藝，研究得到本發明的檢測大腸桿菌殘留宿主蛋白含量的方法，主要用于該RHI成品及其生產過程中殘留宿主蛋白的實時檢測，也可為其它基因工程產品殘留宿主蛋白檢測技術提供借鑒。

發明內容

針對上述問題與不足，本發明提供一種特異性檢測我單位RHI產品中大腸桿菌殘留宿主蛋白含量的方法，該方法靈敏度高、特異性強、重復性好，以該檢測方法控制舒霖牌重組人胰島素的質量，能有效提高產品的安全性，保證其有效性。

本發明是通過以下技術方案實現的：

本發明提供了一種檢測特異性重組人胰島素大腸桿菌殘留宿主蛋白的方法，該檢測方法包括以下步驟：

（1）取含有整合了人胰島素基因的pZRHi-1質粒的大腸桿菌發酵液，進行組織破碎，得到破碎液；

（2）將步驟（1）得到的破碎液超濾，得到宿主細胞總蛋白；

（3）將步驟（2）得到的宿主細胞總蛋白對家兔進行皮下注射免疫；

（4）取免疫后的家兔血清，采用G蛋白親和色譜柱進行純化，得到純化血清抗體；

（5）使人胰島素與CNBr活化的Sepharose4Fastflow色譜柱填料偶聯，處理后得到人胰島素親和色譜柱；

（6）將步驟（4）得到的純化血清抗體通過步驟（5）制得的人胰島素親和色譜柱進行純化，制得特異性抗體；

（7）將步驟（6）得到的特異性抗體用辣根過氧化物酶標記，得酶標抗體；

（8）按照雙抗體夾心法對待測樣品進行測定，得到待測樣品的大腸桿菌殘留宿主蛋白含量。

本發明的技術方案是以整合了人胰島素基因的pZRHi-1質粒的大腸桿菌發酵液破碎、超濾制備的宿主總蛋白作為抗原，刺激家兔產生抗體，繼而采用固定了人胰島素的親和色譜法祛除其中人胰島素抗體，制備特異性抗體，對其采用辣根過氧化物酶標記后采用雙抗體夾心法檢測待測樣品中的殘留宿主蛋白。