[發明專利]禽偏肺病毒抗體ELISA檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201310325109.8
• 申請日: 2013-07-30
• 公開（公告）號: CN103360472A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 劉爵;閻旭;韋莉;王菁;朱珊珊;柳舒航;張春燕;全榮
• 申請（專利權）人: 北京市農林科學院
• 主分類號: C07K14/115
• 分類號: C07K14/115;C12N15/45;C12N15/70;G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 北京瑞思知識產權代理事務所(普通合伙) 11341
• 代理人: 王加嶺

1.A亞群禽偏肺病毒F蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

2.編碼權利要求1所述F蛋白的基因。

3.根據權利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

4.含有權利要求1所述A亞群禽偏肺病毒F蛋白的ELISA檢測試劑。

5.一種A亞群禽偏肺病毒抗體ELISA檢測試劑盒，其包括包被權利要求1所述的A亞群禽偏肺病毒F蛋白的ELISA板。

6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，還包括酶標二抗、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、底物液A、底物液B、終止液、陽性對照和陰性對照中的一種或多種。

7.根據權利要求6所述的ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述酶標二抗為辣根過氧化物酶標記羊抗雞單克隆抗體；所述陽性對照為自然感染A亞群禽肺病毒的雞血清；所述陰性對照為正常雞血清；所述洗滌液每升中含NaCl8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na2HPO₄·12H₂O2.9g，KCl0.2g，Tween-200.5mL；所述樣品稀釋液為含5%脫脂奶粉的洗滌液；所述底物液A每升中含過氧化脲1.0g，Na₂HPO₄·12H₂O35.8g，檸檬酸·H₂O10.3g，Tween-20100μL；底物液B每升中含TMB700mg，DMSO40mL，檸檬酸·H₂O10.3g；所述終止液為2mol/L硫酸溶液。

8.制備權利要求1所述A亞群禽偏肺病毒F蛋白的方法，其包括以下步驟：

人工合成A亞群禽偏肺病毒F蛋白基因序列為模板擴增得到SEQ?ID?No.1所示的序列，將上述目的基因導入到pBCX載體中，連接后的產物轉化DH5α感受態細胞，提取質粒雙酶切后鑒定篩選出陽性重組表達質粒pBCX-aMPV-A-F，將上述陽性重組表達質粒轉化BL21感受態細胞后誘導表達，SDS-PAGE電泳分析表達蛋白，再采用Ni柱親和層析方法，對目的蛋白進行純化，然后分別用SDS-PAGE和Western?blot檢測蛋白純化結果，純化后的目的蛋白用腸激酶處理，處理后用SDS-PAGE檢驗酶切結果，電泳結束后用KCl染色法切膠回收，將回收所得的F蛋白經SDS-PAGE電泳進行回收效果鑒定，ELISA分析切膠回收蛋白的抗原性。

9.根據權利要求8所述的A亞群禽偏肺病毒F蛋白的制備方法，其包括以下步驟：

1）以人工合成A亞群禽偏肺病毒F蛋白基因序列為模板，通過PCR方法對其F基因進行擴增、克隆得到目的基因；

擴增F基因的上下游引物分別是：

上游引物：5’-GGGGTACCGAGGCAGTATCCACATTAGGG-3’

下游引物：5’-CCCAAGCTTCTTGGCATCTGCACCTAG-3’；

2）以Kpn?Ⅰ、Hind?Ⅲ同時對目的基因和pBCX載體進行酶切，回收目的片段，16°C連接過夜，轉化DH5α感受態細胞，提取質粒，經Kpn?Ⅰ和Hind?Ⅲ雙酶切鑒定正確后獲得陽性重組表達質粒pBCX-aMPV-A-F；

3）然后取質粒pBCX-aMPV-A-F轉化BL21感受態細胞，獲得的陽性質粒菌于37°C培養，待A600值達到0.4～0.6時，加入IPTG至終濃度為1.2mmol/L進行誘導表達，收集誘導表達后4h的菌體，超聲波破碎，離心后取沉淀進行SDS-PAGE電泳分析；

4）然后采用Ni柱親和層析方法，純化目的蛋白，純化后的目的蛋白進行SDS-PAGE和Westernblot鑒定，經鑒定的F蛋白用腸激酶進行處理，然后進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后用KCl染色法切膠回收，將回收所得的F蛋白經SDS-PAGE電泳進行回收效果鑒定；

5）ELISA分析切膠回收蛋白的抗原性。