[發明專利]轉基因番木瓜GM YK品系的LAMP檢測試劑

有效

• 申請號: 201310324835.8
• 申請日: 2013-07-30
• 公開（公告）號: CN103421893A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 張吉紅;于澍瓊;陳先鋒;張慧麗;顧建峰
• 申請（專利權）人: 寧波檢驗檢疫科學技術研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

技術領域

本發明涉及檢測番木瓜的試劑，具體涉及轉基因番木瓜GM?YK品系的LAMP檢測試劑。

背景技術

番木瓜（Carica?papaya）又稱木瓜，是十字花目番木瓜科水果。美國從1985年開始致力于開發抗PRSV的轉基因番木瓜研究，1989年對PRSV毒株HA5-1的CP基因進行克隆和測序，開始番木瓜胚胎的基因槍轉化。Fitch等[Fitch?M?M?M,?Manshardt?R?M,?Gonsalves?D,?et?al.?Stable?transformation?of?papaya?viamicro?projectile?bombardment.?Plant?Cell?Rep,?1990,?9:?189~194]成功地將編碼PRSV衣殼蛋白（Coat?protein，CP）基因轉人番木瓜，獲得了轉CP基因的抗病品系“55-1”，并于1997年獲準進入商品化生產。李華平等[Ruan?X?L,?Li?H?P,?Zhou?G?H.?Evaluation?of?PRSV?resistance?of?T2?transgenic?papaya?with?replicase?gene.?Journal?of?South?China?Agricultural?University,?2004,?4:?12-15]將PRSV?YS的復制酶基因（replicase，RP）轉入主栽品種后獲得在我國大陸具有高抗性的轉基因品系“華農1號”。臺灣Cheng等將PRSV?YK株系的CP基因轉化到當地品種中，獲得了對其他PRSV株系（夏威夷、泰國和墨西哥）具有廣譜抗性的轉基因木瓜品系“GM?YK”。臺灣中興大學葉錫東等[Cheng,?Yeh.?Invivo?expression?of?PRSV?CP?genes?with?different?leaders?Bot[J].?Bull?Acad?Sin,?2000,?41:?1-10]采用獨創的液相傷口處理木瓜未成熟胚法，將PRSV?YK?毒株的CP基因轉入“臺農2號”中，獲得了轉基因木瓜品系“GM?YK16-0-1”?、“GM?YK18-2-4”。“華農1號”是我國第1例獲準進行商品化的轉基因果樹作物，2006年獲得農業部頒發的“轉基因番木瓜華農1號在廣東省應用”的安全證書【農基安證字（2006）第001號】，是唯一一種經農業部認可可在中國境內生產和銷售的轉基因番木瓜品系。轉基因番木瓜?“GM?YK”?品系是由臺灣Cheng等轉化的具有廣譜抗性的抗病毒轉基因番木瓜，我國南方地區的PRSV-P4病毒株系也也表現出了較高的抗性。可是轉基因番木瓜?GM?YK?品系在我國南方很多地區進行商業化生產，并大量銷往國內各地區。

針對市場中可能出現的各種轉基因番木瓜，我們常用的轉基因作物檢測方法有定性PCR、復合PCR、實時熒光定量PCR、試紙條等，如韓建勛等的抗病毒轉基因番木瓜的實時PCR檢測[檢驗檢疫學刊2010（1）?15-20]，這些檢測方法在效率、成本和操作性上都具有不同程度的缺陷。環介導等溫擴增技術（LAMP）的反應試劑包括反應緩沖液、反應酶液、特異性引物和顯色劑等，該反應試劑依賴于能夠識別靶序列上6～8個特異區域的引物和一種具解旋功能且呈瀑布式擴增的Bst?DNA聚合酶，在等溫條件下可高效、快速和特異的擴增靶序列。由于LAMP呈瀑布式擴增，因此其擴增效率非常高；同時，LAMP識別靶序列上的6～8個特異性位點，其特異性也很強；LAMP只在60℃～65℃進行恒溫擴增，只要水浴鍋即可，無需特殊的儀器，操作非常簡單；而且LAMP的整個檢測反應只需1.5?h～2.5?h，檢測周期非常短。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種對轉基因番木瓜GM?YK品系具有特異性高、檢測周期短、成本低廉和操作簡單的LAMP檢測試劑。