[發明專利]一種人白細胞介素-38的生產方法

有效

• 申請號: 201310324214.X
• 申請日: 2013-07-29
• 公開（公告）號: CN103397038A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發明（設計）人: 李明才;袁仙麗;李燕;高雪明;高巧艷
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12N15/24
• 分類號: C12N15/24;C12N15/70;C07K14/54
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 謝瀟

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種人白細胞介素-38的生產方法。

背景技術

白細胞介素-38（interleukin-38，簡稱IL-38）是最近發現的IL-1家族細胞因子的第10個成員，主要在皮膚和扁桃體的增殖的B細胞中表達。IL-38基因大小為7.8?kb，其中包含5個外顯子。IL-38的初始翻譯產物是長度為152個氨基酸殘基組成的IL-38前體蛋白，其分子質量約為16.9?kDa。序列分析表明，IL-38蛋白與IL-1Ra、IL-36Ra蛋白分別有41%、43%的相似性，但其與IL-1β及其他IL-1家族成員只有14%~30%的同源性。另有研究表明，IL-38蛋白無保守糖基化位點，如在中國倉鼠卵巢細胞中，IL-38重組蛋白無N/O糖基化。IL-38分子的結構具有與其他典型的IL-1家族成員相似的一般特性。IL-38和一些IL-1家族成員(如IL-36Ra、IL-36α、IL-36β、IL-36γ等)一樣都缺乏信號肽和caspase-1切割位點。并且IL-38的自然N端結構是未知的。有學者根據IL-1Ra和IL-36Ra的結構，通過PSI-BLAST、Seq?Fold分析方法預測IL-38的三維結構，結果顯示其結構與IL-1Ra相似，呈β-三葉草結構。人IL-38基因定位于2q13-14.1。IL-38的特異性受體是IL-36R，是IL-36的部分受體拮抗劑。IL-38可抑制Th17細胞產生的IL-17和IL-22等炎癥介質，也可抑制IL-36γ誘導產生IL-8，從而抑制炎癥反應。與IL-38有類似拮抗作用的IL-1Ra和IL-36Ra分別被證明參與關節炎或牛皮癬等疾病。研究也已證明IL-38的特異性受體是IL-36R，所以IL-38與IL-36介導的相關炎癥性疾病可能有密切關聯。因此，IL-38可能是作為預治炎癥、自身免疫性疾病的一種新型藥物，可用于炎性疾病的預防和治療。但是目前關于IL-38相關報道或生產方法都鮮見報道，更沒有相關產品的問世。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，針對現有技術的不足，提供一種表達效率高的人白細胞介素-38的生產方法。

本發明為解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種人白細胞介素-38的生產方法，采用基因工程方法生產，所述的基因工程方法包括以下步驟：

1）合成PCR引物，并在合成的引物中導入Nde?I和Xho?I酶切位點，

上游引物為5-GGAATTCCATATGTGTTCCCTCCCCATG-3，

下游引物為5-CCGCTCGAGCCAGCTCTGTTCAAAG-3；

2）PCR擴增目的基因：以pcDNA3.1-hIL-38質粒為模板，用上述合成的PCR引物進行PCR擴增，獲得IL-38目的基因片段；

3）構建重組載體：將上述PCR擴增得到的IL-38基因片段行Nde?I、Xho?I雙酶切后電泳回收，與經同樣的雙酶切法進行酶切后的pET-44載體質粒的回收大片段經T4?DNA連接酶定向連接，構建原核表達重組載體pET-44-hIL-38；

4）轉化：將重組載體pET-44-hIL-38轉化大腸桿菌，經測序檢測正確后即為構建的重組IL-38工程菌；

5）培養：培養構建的重組IL-38工程菌，誘導其表達生產IL-38蛋白。

優選地，步驟5）中，用IPTG誘導重組IL-38工程菌表達生產IL-38。

優選地，步驟5）中，所述的IL-38工程菌的培養基為LB液體培養基或LB固體培養基。

優選地，步驟2）中，所述的PCR擴增的反應條件為①98℃預變性5min或95℃預變性10min；②98℃變性10s或95℃變性30s；③58℃退火15s；④72℃延伸1min，②-④共30個循環；⑤72℃充分延伸10min。?

與現有技術相比，本發明的優點如下：本發明人白細胞介素-38的生產方法，采用基因工程技術，根據需求構建得到IL-38重組工程菌，能使IL-38高效表達、高效純化并獲得高純度、高生物活性的IL-38蛋白產品；該工程菌表達的IL-38主要為可溶性成分，純化后相對的生物學活性較高；由于表達的蛋白C端帶有6個His-Tags，用Ni-NAT進行純化即可得到較高純度的IL-38蛋白。IL-38蛋白的成功制備，為探究IL-38在各種炎癥疾病中的作用及機制、信號通路等研究提供了前提，并為開發預治炎癥及自身免疫性疾病的新型臨床藥物奠定了基礎。

附圖說明

圖1為重組質粒pET-44-hIL-38的構建圖譜；