[發明專利]人RUNX2基因的shRNA及其重組干擾載體和應用

有效

• 申請號: 201310323599.8
• 申請日: 2013-07-29
• 公開（公告）號: CN103361351A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 郭政軍;卞修武;楊浪;任勇;劉強;姬成東;崔巍;王強;崔有宏
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及人RUNX2基因的shRNA，還涉及表達該shRNA的重組干擾載體和應用。?

背景技術

全球范圍內，胃癌是位居癌癥死因第三位的惡性腫瘤。在亞洲地區，胃癌是發病率和死亡率居首的消化道惡性腫瘤。盡管目前已有包括消化內鏡在內的多種早期檢查診斷方法，但胃癌的早期診斷率仍然偏低，首診即發現已有遠處擴散與轉移的胃癌患者比例高達60%。目前胃癌治療所采用的方法主要為外科手術切除結合多種化療藥物治療，近年來，隨著診斷手段革新和治療方法提高，胃癌的治療效果得到一定程度的提升，但胃癌患者5年生存率在20%左右的較低水平。隨著腫瘤發生、發展、侵襲和轉移過程中分子生物學，分子病理學研究的深入，分子靶向治療已成為繼手術、化療和放療之后的一種新的治療手段，具有靶向、高效和低毒等特點。?

轉錄因子RUNX2為轉錄因子家族RUNX成員之一，具有一段家族成員共有的由128個氨基酸組成的DNA結合區——Runt結構域。RUNX2轉錄因子可與核心結合因子β（Core?Binding?Factorβ，Cbfβ）結合形成異二聚體，并因此獲得更強的與DNA結合能力。研究發現，轉錄因子RUNX2在成骨細胞和成骨樣肉瘤細胞中表達，是調控成骨分化發育的特異性轉錄因子，并證實RUNX2突變與鎖骨顱骨發育異常綜合癥密切相關。近年來研究還發現，RUNX2在與人腫瘤相關，在易于發生骨轉移的腫瘤，如乳腺癌，前列腺癌和骨肉瘤中發揮著促進骨轉移和溶骨作用。此外，在乳腺癌中，RUNX2與ERa的促增殖作用相互拮抗。2011年向春香等人報道了胃癌細胞SGC7901中存在RUNX2的表達，siRNA抑制RUNX2表達可抑制胃癌細胞的增殖，促進凋亡。但是目前并未見RUNX2與胃癌侵襲轉移相關的報道。?

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種人RUNX2基因的shRNA；本發明的目的之二在于提供含有上述shRNA的重組干擾載體；本發明的目的之三在于提供上述shRNA在制備降低RUNX2基因表達的試劑中的應用；本發明的目的之四在于提供上述shRNA在制備降?低細胞成球能力的試劑中的應用；本發明的目的之五在于提供上述shRNA在制備降低細胞克隆形成能力的試劑中的應用；本發明的目的之六在于提供上述shRNA在制備降低細胞侵襲能力的試劑中的應用；本發明的目的之七在于提供shRNA在制備降低轉錄因子表達的試劑中的應用。?

為實現上述發明目的，技術方案為：?

1.人RUNX2基因的shRNA，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2第5位至第52位所示。?

2.含有所述人RUNX2基因的shRNA的重組干擾載體。?

優選的，所述重組干擾載體由如SEQ?ID?NO.2所示序列連入經AgeI和EcoRI酶切pLKO.1-TRC克隆載體制得。?

3.所述shRNA在制備降低RUNX2基因表達的試劑中的應用。?

4.所述shRNA在制備降低細胞的成球能力的試劑中的應用。?

5.所述shRNA在制備降低細胞克隆形成能力的試劑中的應用。?

6.所述shRNA在制備降低細胞侵襲能力的試劑中的應用。?

7.所述shRNA在制備降低轉錄因子表達的試劑中的應用，所述轉錄因子為轉錄因子Sox2，轉錄因子Oct4或轉錄因子Bmi1。?

本發明的有益效果在于：本發明公開了RUNX2基因的shRNA，該shRNA分子能夠特異干擾靶位點，將RUNX2基因的shRNA與骨架載體連接構建重組干擾載體，經慢病毒包裝后轉染胃癌細胞株MGC803，獲得了穩定下調RUNX2基因表達的胃癌細胞株MGC803-shRUNX2，降低胃癌細胞株中RUNX2基因表達后，胃癌細胞株的干性特性受損，因此干性基因表達下調；同時該細胞還具有細胞成球能力、細胞克隆形成能力和細胞侵襲能力均低的特性，利用此特性可以將RUNX2基因的shRNA用于制備降低細胞的成球能力、細胞克隆形成能力和細胞侵襲能力的試劑，并以此治療胃癌，降低胃癌細胞的成球能力、克隆形成能力和細胞侵襲能力。?

附圖說明

為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖：?

圖1為經過嘌呤霉素篩選后，Real-Time?PCR檢測RUNX2表達結果圖。?