[發(fā)明專利]高活性重組人糜蛋白酶制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310323446.3
• 申請日: 2013-07-29
• 公開（公告）號: CN104342423B
• 公開（公告）日: 2019-11-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙致;安少朋
• 申請（專利權(quán)）人: 上海雅心生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76;A61K38/48;A61P17/02;C12R1/19
• 代理公司: 31100 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司
• 代理人: 陳靜<國際申請>=<國際公布>=<進入國

1.一種制備高活性人糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法包括步驟如下：

(1)將人糜蛋白酶的包涵體進行變性，分離含有經(jīng)變性的人糜蛋白酶的上清；

(2)應(yīng)用復(fù)性液進行復(fù)性，所述復(fù)性液包括100±10mM Tris-HCl；復(fù)性時，調(diào)節(jié)pH8.0±0.2、溫度2～20℃、復(fù)性液:變性液的體積比大于8，經(jīng)激活獲得可溶的高活性人糜蛋白酶；所述的復(fù)性液中，還添加激活劑重組胰蛋白酶、按照體積0.1-0.8％甘油以及1-10mM GSH。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的復(fù)性液中，添加2-6mM GSH。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的復(fù)性液中，添加按照體積0.4-0.6％甘油。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的包涵體如下表達：

(a)將含有人糜蛋白酶編碼基因的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)該大腸桿菌；

(b)用IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌，使之表達人糜蛋白酶的包涵體。

5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，還包括：破碎大腸桿菌細胞，分離獲取沉淀，其中含有人糜蛋白酶的包涵體。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的變性包括：將人糜蛋白酶的包涵體溶解于變性液中變性0.5-6小時；所述變性液包含4-10M尿素以及0.1-100mMβ-巰基乙醇。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)之后，還包括DEAE-FFSepharose陰離子交換柱或CM-FF陽離子交換層析柱進行人糜蛋白酶的純化。

8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，應(yīng)用CM-FF陽離子交換層析柱進行人糜蛋白酶的純化。

9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，還包括：對純化產(chǎn)物進行凍干。

10.如權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于，該方法依次包括：將含有人糜蛋白酶編碼基因的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，發(fā)酵培養(yǎng)該大腸桿菌→離心收集細胞→細胞破碎→離心收集包涵體→包涵體洗滌→包涵體溶解變性→復(fù)性→微濾除菌澄清→超濾濃縮→透析→離子柱純化→濃縮→透析→除菌過濾→凍干。

11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法生產(chǎn)的重組人糜蛋白酶的宿主DNA、宿主蛋白含量均符合2010版藥典對于生物制品的要求。