[發明專利]抗豬圓環病毒2型的表達載體和轉基因豬及其構建方法

有效

• 申請號: 201310321355.6
• 申請日: 2013-07-26
• 公開（公告）號: CN103468733A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 徐志謙;鄒嫻;張獻偉;賀曉燕;石俊松;劉德武;李紫聰;吳珍芳
• 申請（專利權）人: 吳珍芳;李紫聰
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/63;C12N5/10;C12N15/873;A01K67/027
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

1.一種抗豬圓環病毒2型的表達載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)、用XhoI和EcoRI酶切SEQ?ID?NO:1的H1啟動子和質粒pCyL50，純化，連接，轉化感受態細胞，培養后挑選單克隆菌落進行擴大培養，篩選陽性克隆，酶切鑒定，得到pPB-H1質粒；

(2)、以SEQ?ID?NO:2和SEQ?ID?NO:3作為模板及引物進行重疊PCR擴增得到序列號為SEQ?ID?NO:4的pPB-sh2序列，按步驟(1)相同的方法將pPB-sh2序列連接到pPB-H1質粒上，得到序列號為SEQ?ID?NO:11的shRNA分子pPB-H1-sh2；

(3)、分別以質粒pcDNA3.1(+)和pT2AL200R175-CAGGS-EGFP為模板，SEQ?ID?NO:5和SEQ?ID?NO:6、及SEQ?ID?NO:7和SEQ?ID?NO:8為引物進行第一次PCR擴增，純化得到neo基因和EGFP；各取10ng-200ng混合后作為模板進行第二次PCR擴增，純化得到neo-EGFP融合基因；用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切pcDNA3.1(+)和neo-EGFP融合基因，純化回收酶切產物，連接，構建得到pcDNA3.1-Neo-T2A-EGFP載體；

(4)、以SEQ?ID?NO:13的質粒為模板，SEQ?ID?NO:9和SEQ?ID?NO:10為引物，PCR擴增出含有loxP-Neo/EGFP基因表達盒的融合片段；按步驟(1)相同的方法將含有loxP-Neo/EGFP基因表達盒的融合片段連接到pPB-H1-sh2上，得到抗豬圓環病毒2型的表達載體：pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP，序列號為SEQ?ID?NO:12。

2.根據權利要求1所述的抗豬圓環病毒2型的表達載體的構建方法，其特征在于，步驟(2)中重疊PCR擴增的程序為：98℃3min；98℃10s，50℃10s，72℃10s；30個循環；72℃10min。

3.根據權利要求1所述的抗豬圓環病毒2型的表達載體的構建方法，其特征在于，步驟(3)中所述第一次PCR的反應程序為：98℃2min；98℃10s，68℃50s；35個循環；72℃10min；所述第二次PCR的反應程序為：98℃2min；98℃10s；68℃1min40s；35個循環；72℃10min。

4.根據權利要求1所述的抗豬圓環病毒2型的表達載體的構建方法，其特征在于，步驟(4)中所述PCR擴增的反應程序為：98℃3min；98℃30s，65℃30s，72℃3min；35個循環；72℃10min。

5.權利要求1-4任一項所述的構建方法構建得到的抗豬圓環病毒2型的表達載體。

6.一種抗豬圓環病毒2型的轉基因豬的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)、將權利要求5所述的表達載體與轉座酶質粒mPB混合共轉染豬胎兒成纖維細胞系，篩選可穩定表達載體的單克隆轉基因細胞系；

(2)、將獲得的單克隆轉基因細胞系作為核供體細胞，注射到卵母細胞中，構建重構胚胎，采用常規育種技術進行培育，即可得到抗豬圓環病毒2型的轉基因豬。

7.根據權利要求6所述的抗豬圓環病毒2型的轉基因豬的構建方法，其特征在于，所述共轉染的步驟為：

（1）、把表達載體pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP與轉座酶質粒mPB混合加入到1000μL中，混勻；

（2）、加入7μL用前混勻的PLUS^TMReagents，混勻后靜置5min；

（3）、加入21μL用前混勻的Lipofectamine^TMLTX，混勻后靜置30min；

（4）、用DMEM洗單層細胞1-2次，加入1000μL?DMEM，再把上述（3）的混合液左右輕晃混勻，4-6h后換上含有10%胎牛血清的細胞生長培養基，轉染48小時。

8.根據權利要求6或7所述的抗豬圓環病毒2型的轉基因豬的構建方法，其特征在于，所述表達載體pPB-H1-sh2-CMV-Neo/EGFP與轉座酶質粒mPB的摩爾數比為3:1。