[發明專利]一種制備穩定的門冬胰島素結晶的方法

有效

• 申請號: 201310321228.6
• 申請日: 2013-07-26
• 公開（公告）號: CN103342746A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發明（設計）人: 馬瑞;肖擁軍;蔣振東;曹春來;潘太健;周翠;楊曉森
• 申請（專利權）人: 珠海聯邦制藥股份有限公司
• 主分類號: C07K14/62
• 分類號: C07K14/62
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;蘇運貞

技術領域

本發明屬于人工胰島素的純化和制備領域，具體涉及一種制備穩定的門冬胰島素結晶的方法。

背景技術

糖尿病是胰島素分泌缺陷或作用不足導致的以高血糖為特征的代謝紊亂。據2012年11月統計，中國已經躍居成為世界上糖尿病患者人數最多的國家，我國糖尿病患病人數以每小時增加400人次，每天增加1萬人次，患病總數已達到9420萬，患病率高達9.7%，它的危害性僅次于心腦血管疾病和腫瘤。我國約有3/4的糖尿病患者患有并發癥，其慢性高血糖狀態與長期并發癥顯著相關，容易導致腎臟、眼、神經、心臟和血管等眾多器官損害、功能障礙和功能衰竭，危害性極大。

由于飯后葡萄糖的峰值和注射胰島素的峰值二者之間的偏離帶來的問題，從而推動了單體胰島素類似物的產生。20世紀八九十年代，隨著分子生物學技術及基因工程的不斷發展，人們開發出了速效胰島素——重組門冬胰島素（重組Asp^B28-人胰島素）。重組門冬胰島素是通過將人胰島素B鏈B28位的脯氨酸（Pro）突變為天門冬氨酸（Asp）。這一個氨基酸的改變破壞了兩個胰島素單體分子在形成二聚體時重要的范德華力（一個胰島素分子的B28與另外一個胰島素分子的B23所形成），從而使其不易形成二聚體。重組門冬胰島素制劑注射后，其藥代動力學接近正常胰島素的生理分泌曲線。與常規人胰島素對比，其藥代動力學特性是常規人胰島素的一半左右，其起效時間是10～20分鐘，達峰時間為40分鐘，作用持續時間是3～5小時，使患者在獲得良好的血糖控制的同時不會發生夜間嚴重低血糖事件。

固態胰島素中的晶體形式無論從貯藏性能還是后續制劑配方設計等方面都較液態形式方便。此結晶制備方法得到的晶體具有均一穩定的固體分子形式，凍干時間短，樣品穩定性高，因此它更適合與工業化生產。

中國專利CN95106555.6描述了一種速效胰島素——重組賴脯胰島素(Lys^B28-Pro^B29-人工胰島素)的結晶方法：在1M乙酸體系下，含有1.8～2.5g/L重組賴脯胰島素、100～300mg鋅、0.15％～0.25％苯酚、pH5.9～6.2使其形成晶體。賴脯胰島素和門冬胰島素都是單體胰島素類似物，結構和作用方式有一定的相似性，但將賴脯胰島素的結晶方法應用于門冬胰島素，不能形成晶體，而為無定形沉淀。

發明內容

為克服現有技術的缺點和不足，本發明的首要目的在于提供一種制備穩定的門冬胰島素（重組Asp^B28-人胰島素）結晶的方法。該方法可從干燥/凍干固體粉末樣品或純化收集的液體樣品中直接制備門冬胰島素晶體。樣品來源形式靈活（固體粉末或液體形式均可應用于此發明），更好地與上游工藝銜接。該晶體具有沉降體積小，均一穩定，凍干時間短，生產效率高等優點，易于工業化生產。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種制備穩定的門冬胰島素結晶的方法，在含0.2～1.5M甘氨酸體系下，從含有重組門冬胰島素、鋅離子、酚類物質、鹽及有機溶劑的結晶液中，在pH6.0～6.5的條件下使重組門冬胰島素結晶。

具體由以下步驟實現：

在10～30℃條件下，配制含0.2～1.5M甘氨酸，3.0～10.0g/L重組門冬胰島素，體積分數含量為10～30％的有機溶劑，體積分數含量為0.2～0.4%的酚類物質、0.2～0.5M鹽的結晶液，并調節結晶液pH值至6.0～6.5，加入鋅離子，結晶3～6小時，然后降溫至2～8℃靜置12～18小時，獲得穩定的門冬胰島素結晶。

本發明中的有機酸甘氨酸是至關重要的，在乙酸體系下是無法形成甘氨酸體系下均一穩定的固體分子；所述結晶液中有機酸為甘氨酸，其濃度為0.2～1.5M；較優選的濃度為0.5～1.0M。

所述的重組門冬胰島素可以用各種認可的肽合成技術中的任意方法進行制備，優選為溶液法（經典方法）、固相方法、半合成法或DNA重組法（CN86106574A）中的一種方法進行制備；所述的重組門冬胰島素為干燥/凍干固體粉末樣品或純化收集的液體樣品中的一種；所述結晶液中重組門冬胰島素的濃度為3.0～10.0g/L，較優選的濃度為3.0～5.0g/L。

重組門冬胰島素因其B28的突變（相對于人胰島素一級結構），導致其結晶條件較為苛刻，以下為結晶過程中重要的參數和條件：酚類物質的加入和濃度、有機溶劑的加入和濃度以及pH值的調節方式等。