[發明專利]活性增強的酮還原酶突變體、編碼序列及其制備方法

有效

• 申請號: 201310321129.8
• 申請日: 2013-07-26
• 公開（公告）號: CN104342411B
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發明（設計）人: 丁雪峰
• 申請（專利權）人: 南京朗恩生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/62;C12R1/72
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙)32231
• 代理人: 金輝

技術領域

本發明涉及一種酮還原酶，本發明涉及酮還原酶突變體及其制備方法，特別涉及一種源于木蘭假絲酵母的酮還原酶突變體、編碼序列及其制備方法

背景技術

阿托伐他汀鈣（商品名LIPITOR由輝瑞公司銷售）、羅蘇伐他汀鈣（商品名CRESTOR由阿斯利康公司銷售）以及匹伐他汀（商標名Lipalo由Nissan Chemical及Kowa公司在日本銷售），是重要的降膽固醇他汀類藥物。而手性(S)-4-氯-3-羥基-丁酸乙酯是這些重要的他汀類藥物的關鍵的手性中間體。國內2009年該中間體的產量為400噸，預計未來幾年內，國內產量將達到1000噸以上，直接經濟效益在數億元。在已知的制備這些手性中間體的諸多途徑中，包括化學法和酶法，都具有很多缺點。由于化學法合成過程條件苛刻，副反應多，產品分離純化難度大，得率低，成本高，使其難以成為用于商品規模合成的理想方法。采用酶法制備及手性(S)-4-氯-3-羥基-丁酸乙酯需要使用具有立體選擇性的酮還原酶，但現有的野生型酮還原酶催化活性很較低，使用10g/L粗酶粉 20小時僅可轉化 1g/L的酮底物，也使其難以成為用于商品規模合成的理想方法。

木蘭假絲酵母(Candida magnoliae)中天然存在的野生型酮還原酶，能將4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)轉化為(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(S-CHBE)。

發明內容

本發明的目的是供一種活性增強的酮還原酶突變體，其酮還原酶活性比野生型酮還原酶的活性至少增強2-20倍

實現本發明目的的技術方案是：本公開內容的發明人已發現包括在一定位置突變的酮還原酶與木蘭假絲酵母(Candida magnoliae)產生的野生型酮還原酶 (SEQ ID NO：2)相比表現出增加的催化活性。“野生型酮還原酶”、“野生型KRED酶”及“野生型 KRED酮還原酶”指由源自木蘭假絲酵母(Candida magnoliae)的野生型酮還原酶基因SEQ ID NO：1編碼的，并具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的酮還原酶。該酶可將4-氯乙酰乙酸乙酯不對稱還原生成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯?！耙吧汀敝概c自然中所發現的一樣的材料或物質的形式。例如野生型的蛋白質或核酸序列是可以從自然界中的分離并且未經過人為修飾的，在生物體中存在的原始序列形式?！霸黾拥拇呋钚浴敝冈隗w外或體內試驗中所測量的與野生型酮還原酶相比，表現出使底物 (例如4-氯乙酰乙酸乙酯)向產物 (例如S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯)轉化率增加的酮還原酶。

本發明提供一種酮還原酶突變體，其源于木蘭假絲酵母(Candida magnoliae)的野生型酮還原酶，能夠將4-氯乙酰乙酸乙酯轉化為(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。所述酮還原酶突變體，與SEQ ID NO.2的野生型酮還原酶相比表現出更強的催化活性。酮還原酶突變體和編碼這種突變體的多核苷酸可以使用本領域技術人員通常使用的方法制備。突變體可以通過使編碼該酶的體外重組、多核苷酸誘變、DNA改組、易錯PCR和定向進化方法等獲得。

上述酮還原酶突變體，具有選自以下特征中的一個或多個突變：E9R，S42Q，T190L，E234M。

上述酮還原酶突變體，優選自序列SEQ ID NO.4。全長突變的酮還原酶對于保持酶的催化活性并不是必需的。相應地，應考慮酮還原酶突變體的截短的類似物和有催化活性的片段。例如，在一些實施方案中，C端或N端的數個氨基酸可以被刪去。任何特定的截短的類似物或片段可以利用相應的試驗來評估催化活性。同樣的，額外的氨基酸殘基可以被添加到一個或兩個末端而不影響催化活性。額外序列可以是功能性的或非功能性的。例如，額外氨基酸序列可以被用來幫助純化，做為標記，或執行一些其它的功能。因此，本公開內容的酮還原酶突變體可以是融合蛋白的形式，其中酮還原酶突變體(或其片段 )諸如通過助溶標簽 (如SUMO蛋白 )、純化標簽 (如結合金屬的 His標簽 )和細菌定位信號 (如分泌信號 )的實例而非限制的方式被融合到其它蛋白質。

上述酮還原酶突變體，其酮還原酶活性比野生型酮還原酶的活性至少增強2-20倍。

本發明提供一種編碼酮還原酶酶突變體的基因，其優選自SEQ ID NO.3，其已經過序列優化以適于在大腸桿菌中表達。在一些實施方案中，多核苷酸包括被優化用于在特定類型的宿主細胞中表達的密碼子。用于各種不同類型的微生物的密碼子的使用和偏好性是已知的，因為其是用于在這些微生物的表達特定的氨基酸的優化的密碼子。