[發(fā)明專利]一種基因定點(diǎn)突變的構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310320603.5
• 申請(qǐng)日: 2013-07-26
• 公開（公告）號(hào): CN103388006A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李大力;劉明耀;邱中偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華東師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 上海麥其知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

1.一種基因定點(diǎn)突變的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：

(1)在大鼠目標(biāo)基因組序列中確定CRISPR-Cas系統(tǒng)所靶向的靶序列；

(2)設(shè)計(jì)、構(gòu)建能夠識(shí)別并引導(dǎo)CAS蛋白至目標(biāo)基因靶序列的gRNA核酸序列；

(3)將所述gRNA核酸序列與編碼CAS蛋白的核酸序列或蛋白質(zhì)導(dǎo)入所述大鼠胚胎細(xì)胞內(nèi)。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas系統(tǒng)是源于古細(xì)菌II型(CRISPR)-CRISPR-associated?protein(Cas)系統(tǒng)的核酸酶體系。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述gRNA核酸序列能夠和所述CAS蛋白特異性結(jié)合并將其靶向目標(biāo)序列。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，將所述gRNA核酸序列與所述編碼的CAS蛋白核酸序列在體外分別轉(zhuǎn)錄為RNA并純化。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，將所述gRNA核酸序列在體外轉(zhuǎn)錄為RNA后與體外表達(dá)的CAS蛋白混合。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，切割目標(biāo)基因組所形成的DNA斷裂位點(diǎn)通過易錯(cuò)性非同源末端連接修復(fù)或通過同源重組修復(fù)。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)基因的突變包括堿基插入、缺失、改變、移碼突變或敲除。

8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述大鼠目標(biāo)基因組序列包括編碼基因的基因組序列、低度重復(fù)序列、中度重復(fù)序列、高度重復(fù)序列、低拷貝序列、基因間的轉(zhuǎn)錄活躍序列或非轉(zhuǎn)錄序列。

9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述大鼠胚胎細(xì)胞包括大鼠單細(xì)胞受精卵或多細(xì)胞大鼠胚胎。

10.一種按權(quán)利要求1-9所述方法制備獲得的大鼠胚胎細(xì)胞。