[發明專利]一種酮還原酶突變體及其制備方法

有效

• 申請號: 201310319519.1
• 申請日: 2013-07-26
• 公開（公告）號: CN104342410B
• 公開（公告）日: 2017-04-19
• 發明（設計）人: 丁雪峰
• 申請（專利權）人: 南京朗恩生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙)32231
• 代理人: 金輝

1.一種酮還原酶突變體，其源于釀酒酵母的野生型酮還原酶，能夠使5-羥基-3-氧代己酸酯轉化為對應的順式3,5-二羥基己酸酯，其序列為SEQ ID NO.4。

2.一種多核苷酸，其編碼如權利要求1所述的酮還原酶突變體。

3.如權利要求2所述的多核苷酸，其序列為SEQ ID NO.3。

4.一種重組質粒，其包括表達載體連接權利要求3所述的多核苷酸，所述載體序列為SEQ ID NO.5。

5.一種宿主細胞，其包含權利要求4所述的重組質粒。

6.根據權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于：所述細胞是大腸桿菌，為大腸桿菌W3110，DH1，和JM109中的一種。

7.一種如權利要求1所述酮還原酶突變體的制備方法，包括以下步驟：(a)構建表達酮還原酶突變體的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主細胞，表達載體以及酮還原酶突變體基因，所述宿主細胞為大腸桿菌W3110，DH1，和JM109中的一種；(b)篩選得到所述基因工程菌；(c)培養所述基因工程菌；(d)誘導表達所述基因工程菌；(e)收集和制備酮還原酶突變體。

8.根據權利要求7所述酮還原酶突變體的制備方法，其特征在于：所述步驟（c）為挑取含有目的表達載體的大腸桿菌單菌落接種于10ml 高壓滅菌后的第一培養基中， 30℃，250rpm過夜培養；次日取1L三角瓶，按1：100的接種比例接入到100ml高壓滅菌后的第二培養基中，于30℃中培養至菌體OD 5-6，立刻將三角瓶置于25℃搖床中，250rpm培養1h，加入IPTG至終濃度0.1mM，并于25℃，250rpm繼續培養15h。

9.一種生產他汀類藥物的關鍵的手性中間體的方法，包括在與權利要求1所述的酮還原酶突變體的存在下，使5-羥基-3-氧代己酸酯還原成對應的順式3,5-二羥基己酸酯。