[發明專利]一種電化學適配體傳感器檢測痕量赭曲霉毒素A的方法

有效

• 申請號: 201310319335.5
• 申請日: 2013-07-26
• 公開（公告）號: CN103424448A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 王坤;錢靜;楊興旺
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

技術領域

本發明涉及一種用于痕量赭曲霉毒素A（OTA）檢測的電化學傳感器的制備方法，特點在于赭曲霉毒素A適配體應用和基于金納米粒子與富含堿基G的DNA的信號放大策略構建，以及該檢測方法的高特異性、高靈敏度及易操作性，屬于電化學傳感器技術領域。

背景技術

赭曲霉毒素A（Ochratoxin?A，簡稱OTA）是赭曲霉屬真菌產生的有毒代謝產物，屬于典型的食源性真菌毒素。純的OTA是穩定的無色結晶化合物，其化學式為C₂₀H₁₈ClNO₆，微溶于水，易溶于稀碳酸氫鈉溶液。在極性有機溶劑中OTA能穩定存在，如OTA的乙醇溶液在冷藏條件下可穩定存在一年以上，但OTA在紫外線照射下很快就會分解。在動物體內OTA非常穩定、不易被代謝降解，而且OTA在多種動物體內存在毒性，研究發現其毒性主要是腎臟毒性、肝臟毒性、免疫毒性、致畸毒性和致癌性。1993年，OTA被國際癌癥研究機構定為2B類致癌物。OTA的產生主要來源于OTA產生菌，這些霉菌在糧谷類、干果、葡萄及葡萄酒、咖啡、中草藥、調味品、罐頭食品、油、橄欖、豆制品、啤酒、茶葉等多種農副產品的生產、加工過程中都有可能出現。另一方面，動物在進食受到OTA污染的飼料后，會因OTA的不易代謝降解而在體內蓄積。人在食用這些被OTA污染的動物組織后，對人的生命安全將會產生潛在的危害。美國、歐洲等發達國家已經初步確立了真菌毒素檢測的法規和標準。例如，食品法典委員會規定了小麥、大麥、黑麥等谷物及其產品的OTA限量標準為5.0?μg/kg。歐盟委員會對谷物產品、葡萄酒等食品的OTA限量標準更為嚴格，要求谷物產品中的OTA≤3.0?μg/kg，葡萄酒中的OTA≤2.0?μg/kg。世界衛生組織還在1995年規定，OTA的每日攝入量為14?ng/kg，有報道更表示在長期飲用葡萄酒的地區，OTA的每日攝入量應低至0.15?ng/kg。

目前食品、飼料中真菌毒素的傳統檢測方法主要依靠生物鑒定法、化學分析法以及儀器分析法。生物鑒定法主要用于定性判斷真菌毒素的存在性，由于專一性不強，靈敏度較低，費用較高，實驗周期較長等缺點，目前僅作為化學分析方法的輔助方法?；瘜W分析法最常用的為薄層層析法，優點是對設備和檢驗人員要求不高，但精確度低、操作過程復雜、分析結果的可重復性和再現性差，檢出限只能達到10?μg/kg，目前僅用作半定量分析。較為常用的、檢測精確度較高的儀器分析法是高效液相色譜法（HPLC），該方法具有靈敏度高、分離能力強、特異性好、測定結果可靠等優點。但HPLC儀器設備昂貴、操作技術水平要求高、常需要對樣品進行衍生化、對樣品的前處理要求嚴苛、具體操作所使用的化學藥劑和處理途徑差別很大，易對實驗結果的精確度造成影響，因此難以推廣普及。鑒于這些檢測方法所存在的局限性，發展簡便、快速、靈敏、高效的真菌毒素檢測新方法與新技術已成為迫在眉睫的重要研究課題。

基于分子識別原理的酶聯免疫檢測（ELISA）技術是根據抗原與抗體反應后物理化學性質發生的變化，實現對抗原與抗體形成的免疫復合物進行測定的免疫標記分析法。因其靈敏度高，特異性強，快速、經濟簡便、無需對樣品進行分離純化等特點，格外受到研究者的青睞。ELISA檢測中關鍵的一步是制備具有特異性高的單克隆抗體，而OTA是小分子物質，屬于半抗原，即只有反應原性，無免疫原性，因此必須與大分子物質（如蛋白質等）結合后，利用大分子的T細胞表位刺激機體才能產生抗體特異性免疫應答，制備過程繁瑣耗時、成本昂貴。核酸適配體（aptamer）是可以折疊成三維結構的、通過空間構型互補與靶分子高親和性、高特異性結合的一段寡核苷酸序列。作為一種新型分子識別元件，與抗體相比有著顯著的優勢：靶分子范圍更廣，涵蓋了蛋白質、核酸、細胞以及其它無機、有機分子；高識別特異性，能夠分辨出靶分子結構上的細微差別；由于aptamer是人工合成的，故具有較高的純度和加工精確性、重復性；可以在合成時精確、定點、隨意連接其他功能基團和分子。因而發展以適配體為分子識別元件的傳感器已經成為食源性真菌毒素檢測領域的重點研究課題。