[發(fā)明專利]一種蠟蚧菌蛋白酶分離純化的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310318906.3
• 申請(qǐng)日: 2013-07-27
• 公開（公告）號(hào): CN103409399A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邱君志;董冬;涂潔;李小霞;孟麗雪;何肖云;曹麗萍;張以盼;郭慶豐;姚靈丹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/58
• 分類號(hào): C12N9/58
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及蛋白酶的分離純化工藝。更具體地，本發(fā)明涉及一種蠟蚧菌蛋白酶的分離純化方法。?

背景技術(shù)

蠟蚧菌隸屬絲孢菌類(Hyphomycetes)，廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶，能寄生蚧類、蚜蟲類、螨類和粉虱，還可寄生鱗翅目的一些害蟲及線蟲、薊馬等。20世紀(jì)70年代以來，歐洲一些國(guó)家及美國(guó)、日本等國(guó)對(duì)利用蠟蚧菌防治溫室蔬菜害蟲給予極大重視。蠟蚧菌對(duì)保護(hù)地粉虱各蟲態(tài)均可感染，可以在粉虱種群中流行。在不適宜傳播條件時(shí)，能在溫室中生存一段時(shí)間。且蠟蚧菌的流行受粉虱種群密度的限制不大，不受人工培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)代培養(yǎng)次數(shù)等的影響，致病力穩(wěn)定，不易變異。因此該菌被認(rèn)為是防治粉虱的重要病原微生物，而得到大力研究與開發(fā)。

蛋白酶是一類可以催化蛋白質(zhì)水解反應(yīng)的酶，廣泛存在于各種生物體中。它們參與細(xì)胞的正常生理以及異常的病理?xiàng)l件下的諸如蛋白質(zhì)水解、細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移、酶原激活、激素釋放等各種復(fù)雜的過程。蛋白質(zhì)是昆蟲體壁的重要組成部分，而穿透體壁是在昆蟲病原真菌感染寄主的重要過程之一。蠟蚧菌胞外蛋白酶可分解蛋白質(zhì)性質(zhì)的昆蟲表皮，這有助于菌絲的入侵，并為菌絲提供營(yíng)養(yǎng)。對(duì)蛋白酶進(jìn)行分離純化和其蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的初步研究，為揭示蟲生真菌致病機(jī)理并指導(dǎo)其生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，可為將來真菌防治害蟲的深入研究提供科學(xué)依據(jù)。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種蠟蚧菌蛋白酶分離純化的方法，為蛋白酶基因的克隆表達(dá)和揭示蟲生真菌致病機(jī)理并指導(dǎo)其生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)；

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：

（1）用優(yōu)化試驗(yàn)篩選出的培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株，在蛋白酶活性達(dá)最高時(shí)取發(fā)酵液；

（2）蠟蚧菌蛋白酶，在上述發(fā)酵液基礎(chǔ)上，由下述純化方法獲得：

（2.1）粗酶液的制備：將發(fā)酵液在8500rpm離心10min，上清液用真空抽濾，收集濾液。向?yàn)V液中加入固體硫酸銨至飽和度為60%wt，4℃靜置過夜。11000rpm、4℃離心15min收集沉淀，用適量的溶解沉淀。12000rpm、4℃離心15min除去不溶物體，上清液0.02mol/L?Tris-HCl緩沖液（pH8.0）經(jīng)透析，再用聚乙二醇濃縮后即為粗酶液。

（2.2）DEAE?Sepharose?fast?flow陰離子交換柱層析：用0.02mol/L?Tris-HCl緩沖液(pH8.0)充分平衡DEAE?Sepharose?fast?flow陰離子交換柱層析柱，上樣經(jīng)過PEG20000濃縮的粗酶液，先用0.02mol/L?Tris-HCl緩沖液(pH8.0)沖洗層析柱，后換用0-1mol/L?NaCl的0.02mol/L?Tris-HCl緩沖液(pH8.0)進(jìn)行連續(xù)洗脫。洗脫條件設(shè)置為：流速30mL/h；5mL/管，收集具有酶活性部份。

（2.3）Sephadex?G-150分子篩層析：通過0.02mol/L?Tris-HCl緩沖液（pH8.0）充分平衡的Sephadex?G-150分子篩層析柱（1.8×100），將2.1收集的具有酶活性部分上樣于其，再用相同的緩沖液進(jìn)行洗脫。洗脫條件設(shè)置為：流速15mL/h；5mL/管。收集酶活性部位。

（2.4）純化蛋白酶的分子量檢測(cè)：采用不連續(xù)垂直板電泳系統(tǒng)測(cè)定蛋白酶的純化程度及分子量，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%，凝膠大小為100?mm×70×0.75mm。所用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白為：磷酸化酶B94?000；牛血清蛋白67?000；肌動(dòng)蛋白43?000；碳酸酐酶30?000；大豆蛋白酶抑制劑20100；乳清蛋白?14?400。電泳后用考馬斯亮藍(lán)法顯示蛋白條帶。

本發(fā)明采用的殺蟲蠟蚧菌為蠟蚧輪枝菌L.?lecanii?FJ28（邱君志等，金屬離子對(duì)蠟蚧菌幾丁質(zhì)酶活力的影響，激光生物學(xué)報(bào)，2009年2月）。

本工藝特異性高，工藝簡(jiǎn)單，蛋白質(zhì)不易失活，純化效果好，回收率高，成本低，具有很好的推廣應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1蛋白酶液的DEAE?Sepharose?fast?flow陰離子交換柱層析結(jié)果

圖2蛋白酶液的Sephadex?G-150分子篩層析結(jié)果

圖3?蠟蚧菌蛋白酶純化過程中各步活性成分SDS-PAGE圖譜；其中泳道M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，泳道1為60%(NH₄)₂SO₄沉淀粗酶液，泳道2為經(jīng)Sephadex?G-150分子篩層析后的純酶。

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具體實(shí)施方法：