[發明專利]靶向性重組PF4及其表達系統

有效

• 申請號: 201310318276.X
• 申請日: 2013-07-25
• 公開（公告）號: CN103387617A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發明（設計）人: 黃鶴;王喆;段毅濤;甘一如;王聽月
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 王麗

技術領域

本發明涉及一種抑制腫瘤生長的重組肽，將PF4^47-70與環狀RGD肽連接構成靶向性重組PF4，并構建其表達系統，屬于抗癌基因藥物及其技術領域。?

背景技術

血小板因子四是一種具有多種生物學功能的趨化因子，它能夠通過抑制內皮細胞的增殖與遷移抑制血管生成，且其47-70肽段抑制活性最強。RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的短肽,能夠與腫瘤細胞表面高表達的整合素αvβ3結合，因此可作為腫瘤靶向肽進行腫瘤的診斷與治療，且含有2個二硫鍵的環形RGD肽對腫瘤新生血管內皮細胞的抑制效力最強。而腫瘤的生長與轉移依賴于血管的新生，因此抑制腫瘤血管生成已成為一種腫瘤治療的策略。本發明就是將血小板因子四（PF4）47-70肽段和環狀RGD肽巧妙的結合，構建成靶向性重組PF4。它能保證在抑制血管生成的作用下，增加靶向性，降低副作用，從而更有針對性的抗癌。?

發明內容

本發明的目的是提供一種靶向性重組PF4。?

本發明的第二個目的是提供一種靶向性重組PF4的基因序列。?

本發明的第三個目的是提供一種靶向性重組PF4的DNA表達載體。?

本發明的第四個目的是提供一種靶向性重組PF4的表達系統。?

本發明的技術方案概述如下：?

一種靶向性重組PF4，它同時包含PF4^47-70肽段和環狀RGD肽的氨基酸序列；PF4^47-70肽段氨基酸序列為：NGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLES；環狀RGD肽氨基酸序列：ACDCRGDCFCG；具體結構為NGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLES?nX?ACDCRGDCFCG或ACDCRGDCFCG?nX?NGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLES；其中nX為連接肽，X是20種人體氨基酸中的一種或多種，n的個數為0至200。?

本發明的靶向性重組PF4基因序列，其設計過程包括以下步驟：?

1）確定靶向性重組PF4各部分肽段的基因序列：根據NCBI數據庫中編號為NM_002619.3的PF4基因序列，選取PF4信號肽基因及PF4^47-70基因；根據PDB數據庫中編號為1FUV_A的環狀RGD肽氨基酸序列，確立其基因序列；確立連接肽氨基酸序列及其基因序列。?

2）拼接、優化獲得靶向性重組PF4基因序列：拼接各部分肽段基因序列，并進行密碼子優化，優化的得到的基因序列能夠編碼權利要求1的靶向性重組PF4。?

本發明的靶向性重組PF4的DNA表達載體，是通過將靶向性重組PF4基因序列插入商業化DNA表達載體的合適區域而構建成的，以實現靶向性重組PF4基因的有效表達。?

本發明的靶向性重組PF4的表達系統，是通過將靶向性重組PF4的DNA表達載體導入細胞內而構建成的。?

檢測靶向性重組PF4及其表達載體的生物學活性。分別對靶向性重組PF4的體外抑制血管生成活性和靶向性重組PF4的表達載體的體內抑瘤活性進了檢測，均達到滿意效果。本發明的一種靶向性重組PF4在體外能夠抑制人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）增殖，抑制率為50.8%；其真核表達質粒在荷瘤裸鼠瘤體內能夠抑制腫瘤生長，最大抑制率達80.73%。?

附圖說明

圖1真核表達質粒pcDNA3.1(+)-PF4⁴⁷-⁷⁰-RGD構建圖?

合成靶向性重組PF4基因序列，用HindⅢ和XbaⅠ進行雙酶切，然后用T4連接酶連接入真核表達載體pcDNA3.1(+)，構建出真核表達載體pcDNA3.1(+)-PF4^47-70-RGD。?

圖2pcDNA3.1(+)-PF4^47-70-RGD質粒HindⅢ、XbaⅠ雙酶切產物電泳圖?

泳道1:DM50005000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp泳道2：pcDNA3.1(+)-PF4^47-70-RGD質粒?

泳道3：pcDNA3.1(+)質粒?

泳道4：MakerⅠ600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp?

泳道5：經HindⅢ、XbaⅠ雙酶切過的質粒pcDNA3.1(+)?