[發(fā)明專利]一種熱穩(wěn)定的淀粉酶突變體及其制備方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310317927.3
• 申請日: 2013-07-25
• 公開（公告）號: CN103409392A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設計）人: 陳堅;堵國成;劉龍;李江華;楊海泉;鄧壯梅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/28
• 分類號: C12N9/28;C12N15/56;C12N15/10;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/07
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發(fā)明涉及一種熱穩(wěn)定的淀粉酶突變體及其制備方法，具體涉及一種具有較高熱穩(wěn)定性的堿性淀粉酶突變體及其制備方法。

背景技術

淀粉酶能水解淀粉分子內部α-1,4-葡萄糖苷鍵，水解產(chǎn)物為糊精、麥芽寡糖、麥芽糖和葡萄糖，在食品、紡織、醫(yī)藥和飼料等工業(yè)領域廣泛應用。堿性淀粉酶在強堿性條件下水解淀粉的潛力，使其可以應用于淀粉加工、紡織退漿以及用于自動洗衣機的洗滌劑添加等工業(yè)領域。添加堿性淀粉酶可有效除去餐具和衣物上的淀粉類污垢，提高紡織品印染質量，有著良好的實際應用效果和廣闊的市場需求，相關研究也因此受到廣泛重視。

堿性淀粉酶退漿主要應用淀粉酶催化淀粉大分子鏈水解，生成分子質量較小、黏度較低和溶解度較高的低分子化合物，再經(jīng)水洗即可去除。這種方法催化速度快，對環(huán)境污染小，因而受到印染工作者的重視。為了滿足印染行業(yè)連續(xù)化生產(chǎn)的要求，需要淀粉酶能夠在高溫下使用，但是目前大多數(shù)淀粉酶在高溫下的穩(wěn)定性較差。因此基于已得到的堿性淀粉酶在大腸中的表達平臺，利用定點突變，對堿性淀粉酶進行分子改造，以期得到酶學性質更適合工業(yè)應用的堿性淀粉酶。

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種熱穩(wěn)定的淀粉酶突變體，其特征在于，通過定點突變或置換方法在淀粉酶催化結構域內引入一對或多對二硫鍵，獲得具有較高熱穩(wěn)定性的淀粉酶突變體。

所述淀粉酶突變體是以SEQ?ID?NO.1為出發(fā)序列，具有下述1）～3）中的至少一種突變的氨基酸序列：

1）第25位氨基酸由脯氨酸替換成半胱氨酸，第416位氨基酸由甘氨酸替換成半胱氨酸；

2）第106位氨基酸由甘氨酸替換成半胱氨酸，第110位氨基酸由谷氨酰胺替換成半胱氨酸；

1）第426位氨基酸由組氨酸替換成半胱氨酸，第470位氨基酸由甲硫氨酸替換成半胱氨酸。

能表達生產(chǎn)權利要求1-2所述淀粉酶突變體的載體也屬于本專利要求保護的范圍。

能表達生產(chǎn)權利要求1-2所述淀粉酶突變體的基因工程菌或轉基因細胞系也屬于本專利要求保護的范圍。

本發(fā)明還提供一種制備所述淀粉酶突變體的方法，具體步驟如下：

1）根據(jù)嗜堿芽孢桿菌淀粉酶序列SEQ?ID?NO.1所示，采用化學全合成的方法全合成后克隆到質粒pET-22b(+)中，構建重組質粒pAmyQ；

2）通過Swiss-model軟件對源自嗜堿芽孢桿菌淀粉酶（SEQ?ID?NO.1）進行模擬，獲得淀粉酶空間結構；

3）利用生物信息學軟件對淀粉酶的氨基酸序列以及空間結構進行分析，確定在淀粉酶催化結構域內引入二硫鍵的位點；

4）設計突變引物，對淀粉酶基因序列進行定點突變，將所述位點的氨基酸進行替換，獲得含有突變淀粉酶序列的重組載體；

5）將突變后重組載體轉化大腸桿菌BL21，誘導表達，獲得淀粉酶突變體。

本發(fā)明提供的堿性淀粉酶突變體熱穩(wěn)定性顯著提高，在60℃的半衰期由對照（突變前）例的3.2min的提高到22.3min，提高了7倍。相對于采用篩菌或誘變等手段，縮短了酶學性質改造時間。將該堿性淀粉酶突變體應用于紡織、洗滌劑、制革等領域，可以在耐溫耐堿環(huán)境下高效降解淀粉，具有廣闊的應用前景。

具體實施方式

實施例1：淀粉酶熱穩(wěn)定性定點突變分析與方法

通過Swiss-model軟件對源自嗜堿芽孢桿菌淀粉酶（SEQ?ID?NO.1）進行模擬，獲得淀粉酶空間結構，利用軟件Disulfide?by?Design^TM預測淀粉酶結構中可能生成的二硫鍵。在此基礎上再利用Swiss-model模擬突變后酶的空間結構，用Discovery?Studio軟件分析是否形成二硫鍵，得到能形成二硫鍵的氨基酸位點。最后利用Discovery?Studio軟件分析能形成二硫鍵的氨基酸位點突變對酶分子內部形成氫鍵、鹽橋的影響，同時考慮突變位點與活性中心的距離，最終確定在淀粉酶催化結構域內引入二硫鍵的位點（Pro25-Gly416,Gly106-Gln110和His426-Met470）。

根據(jù)嗜堿芽孢桿菌（Bacillus?alcalophilus）淀粉酶序列，采用化學全合成的方法全合成后，克隆到質粒pET-22b(+)中，構建重組質粒pAmyQ。