[發明專利]耐福美雙的桑氏鏈霉菌突變株ΜV-2及其液體制劑與制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310317257.5
• 申請日: 2013-07-25
• 公開（公告）號: CN103396961A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發明（設計）人: 朱天輝;余琴;李姝江;張靜;韓珊;張麗娜;譙天敏;鄭磊
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/00;A01P3/00;C12R1/465
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術領域

本發明涉及的是一株耐福美雙的桑氏鏈霉菌突變株ΜV-2及其液體制劑與制備方法和應用。

背景技術

隨著近代對化學農藥的過度依賴，很多病原真菌對化學農藥產生了強烈的抗藥性，更進一步導致了化學農藥的濫用，對全球的環境健康和食品安全構成了巨大威脅。目前，應用生物防治控制植物病害已經越來越受到世界各國的重視，篩選有益微生物，由生防微生物開發的農藥已成為國內外生物防治研究的熱點。但能夠實際應用到植物病害防治上的還很少。四川農業大學林學院森保實驗室從楊樹根系分離得到了一株對楊樹紫絲核菌有抑制作用的桑氏鏈霉菌KJ40。國內對桑氏鏈霉菌的研究較少，Jain從花園的土壤中分離得到S.sampsonii菌株，發現具有抗真菌活性。

野生鏈霉菌株對農藥的抗藥性差，當施用農藥后對具生防作用的菌株也有殺滅效果，造成生防作用下降或者無明顯生防作用。報道顯示，生防菌和化學農藥混合使用，不僅可以降低農藥的使用量，減輕對環境的污染，還因為化學殺菌劑的使用削弱了病原菌的生長，使其對生防菌更加敏感，從而提高了生防菌的防治效果。實現生防菌和化學農藥綜合利用的前提是生防菌對化學農藥要有一定的耐藥性。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是在前一發明專利（201210122697.0）基礎上通過人工誘變技術獲得一株耐福美雙的桑氏鏈霉菌突變株ΜV-2，耐福美雙的桑氏鏈霉菌突變株ΜV-2生物型與發明人的前一發明（201210122697.0）相比，可顯著提高預防、治病能力和促生效果。

本發明的技術方案如下：

耐福美雙的桑氏鏈霉菌突變株ΜV-2，該菌株已于2013年7月15日保藏在中國北京市朝陽區中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏編號為CGMCCNO：7920，分類命名為桑氏鏈霉菌Streptomyces?sampsonii。

本發明采用紫外線照射與藥物培養基馴化相結合的方法，選育對福美雙具有抗性的桑氏鏈霉菌突變菌株，通過篩選獲得抗福美雙突變株，結合化學農藥聯合控制楊樹紫紋羽病。通過紫外誘變和藥劑馴化后，拮抗菌對楊樹紫紋羽病菌的拮抗效果發生顯著變化。有的突變株拮抗活性減弱，如ΜV-5，對楊樹紫紋羽病菌無抑制效果；有的突變株對菌絲的拮抗活性無顯著變化，如ΜV-1和ΜV-3。有的突變株拮抗活性增強，如ΜV-2和ΜV-4，抑制率分別是80.39%和76.08%大大高于原KJ40的抑制率。

具體實施方式

以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。

（一）耐福美雙的桑氏鏈霉菌生物型的選育

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株：

（1）生防菌：桑氏鏈霉菌（Streptomyces?sampsonii）KJ40菌株（該菌株在中國專利201210122697.0已經公開并提交保藏證明）。

（2）病原菌：楊樹紫紋羽病（紫絲核菌（Rhizoctonia?crocorμm?Fr.）），油橄欖焦枯菌，桉焦枯菌，板栗疫病菌，紅豆杉根腐，山茶灰斑病。

1.1.2供試藥劑

福美雙40%、甲基硫菌靈30%甲硫·福美雙（山東濰坊萬盛生物農藥有限公司）

1.1.3培養基

牛肉膏蛋白胨培養基：葡萄糖10g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，瓊脂粉20g，NaC15g，水1000mL，pH7.0～7.2；用于放線菌的培養。

PDA培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000ml，pH自然；用于拮抗性測定。

1.2方法

1.2.1福美雙對鏈霉菌孢子致死濃度的測定

鏈霉菌KJ40斜面25℃培養2d，將其制備成單孢子懸液。將制備好的出發菌株孢子懸液分別涂布于含福美雙1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的牛肉膏蛋白胨培養基平板上，以不加福美雙的處理為對照，置于25℃恒溫培養箱中培養。2d后逐日觀察記載菌落生長情況。凡是在前一個低濃度平板上長出菌落而在后一個較高濃度平板上未長出菌落的，后一濃度即為福美雙對出發菌株的孢子的致死濃度。

表1福美雙對菌株KJ40孢子的致死濃度測定

由表1可知，福美雙對菌株KJ40孢子的致死濃度為40μg/mL，以此為菌株KJ40抗藥性致死突變的標注。將在40μg/mL長出的5株耐藥菌株平板劃線培養后保存。