[發(fā)明專利]CeDGAT1基因及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310316565.6
• 申請日: 2013-07-25
• 公開（公告）號: CN103397007A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡贊民;郭雪潔;陳宇紅;尹維波
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/63;C12N1/19;C12N5/10;C12N15/81;C12N15/82;C12N1/21;C12P7/64;C12R1/865;C12R1/01
• 代理公司: 北京市漢信律師事務(wù)所 11373
• 代理人: 王文生

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種二酰基甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因DGAT1及其應(yīng)用。具體地，涉及該基因序列的獲得和酵母表達(dá)載體的構(gòu)建，以及其能大幅度提高酵母脂肪酸含量方面的研究。

背景技術(shù)

微藻是遍布全球水體的浮游植物，具有產(chǎn)能大、無污染、可再生、易培養(yǎng)、含有較多的脂類物質(zhì)等優(yōu)點，在能量轉(zhuǎn)化和碳元素循環(huán)中具有重要的作用。有些微藻把光合作用產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為脂肪酸，進(jìn)一步合成三酰甘油(TAG)，在細(xì)胞中以油滴的形式貯藏起來。微藻細(xì)胞中的三酰甘油可達(dá)到干重的20％-50％，提取后通過轉(zhuǎn)酯化后可轉(zhuǎn)變?yōu)橹舅峒柞ィ瓷锊裼汀４送猓⒃暹€具有較大的食用和化學(xué)利用價值。基于以上多方面的優(yōu)勢，微藻被認(rèn)為是當(dāng)今最有開發(fā)前途的能源原料之一^[1-3]。小球藻(Chlorella)是微藻中的一類，屬于綠藻門小球藻屬，是一種真核單細(xì)胞微藻，直徑大約3-8微米。小球藻繁殖速度很快，含有豐富的營養(yǎng)元素，例如蛋白質(zhì)、油脂、多不飽和脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)、食物纖維、核酸及葉綠素等，還含有多種生物活性物質(zhì)，例如糖蛋白、多糖。小球藻可以進(jìn)行光自養(yǎng)培養(yǎng)、也可以進(jìn)行無光照的異養(yǎng)培養(yǎng)，而且是少數(shù)幾個可用于大規(guī)模培養(yǎng)的微藻。所以，小球藻是進(jìn)行能源微藻研究的一個潛在的理想材料^[4]。

三酰甘油(TAG)在大部分生物體中都是最主要的儲藏脂類，包括脊椎動物、油料作物、真菌以及微藻。在微藻中，TAG一般在逆境條件下積累于油體^[5]。首先，在質(zhì)體中，乙酰-CoA在乙酰-CoA羧化酶(ACCase)的作用下形成丙二酸單酰-CoA；丙二酸單酰-CoA進(jìn)行逐步的縮合反應(yīng)，從二碳單酰基載體蛋白(ACP)開始，依次把二碳單位帶入脂酰鏈，經(jīng)過數(shù)次循環(huán)聚合以及去飽和反應(yīng)后形成不同碳鏈長度的酰基-ACP，然后在酰基輔酶A合成酶(ACS)的作用下合成酰基輔酶A，并從質(zhì)體轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或胞質(zhì)中，成為真核生物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)三酰甘油合成的底物。游離脂肪酸被酯化生成酯酰輔酶A(CoA)后，在膜結(jié)合的甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(GPAT)，溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(LPAT)，二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)3種酰基轉(zhuǎn)移酶作用下，依次把甘油骨架第一至第三位經(jīng)酰基化合成三酰甘油，該生物合成過程就是通常所說的Kennedy途徑^[6-7]。

二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)催化TAG合成途徑即Kennedy途徑的最后一步，也是該途徑唯一的限速酶。DGAT被認(rèn)為是在TAG合成過程中起主要作用的酶，普遍存在于所有已研究的真核生物中。到目前為止，共發(fā)現(xiàn)3類DGAT基因家族，包括DGAT1、DGAT2和DGAT3基因家族^[8-9]。Cases等^[10]在小鼠中克隆了第一個DGAT1基因后，Hobbs等^[11]在擬南芥中克隆了DGAT1基因，該基因在擬南芥中僅有一個拷貝。AtDGAT1基因在野生型擬南芥中過量表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，DGAT1轉(zhuǎn)錄水平和活性明顯提高(10％-70％)，油脂積累增加，種子平均重量增加^[12]。隨后，油菜、蓖麻、煙草、大豆、玉米、橄欖、紅花、向日葵、火焰衛(wèi)矛和百脈根等植物中DGAT1基因也相繼被克隆^[13-16]。近年來，Lock^[17]等通過將一個BnDGAT1反義基因轉(zhuǎn)化到油菜DH12075中發(fā)現(xiàn)，DGAT1基因的表達(dá)量、總體DGAT蛋白的酶活性和種子的含油量都有明顯的下降，同時，種子的產(chǎn)量以及萌發(fā)率也比轉(zhuǎn)化前降低，而且種子發(fā)育嚴(yán)重畸形。這些結(jié)果表明，DGAT除了在總油脂形成中有重要作用以外，它還影響種子的正常發(fā)育，但是具體的調(diào)控機(jī)制目前還不清楚。目前，在一些微藻中也克隆到了DGAT1基因，Boyle等人在衣藻中克隆了一個DGAT1基因^[18]，Guiheneuf等在三角褐指藻中也克隆到DGAT1基因^[5]。萊茵衣藻和三角褐指藻中DGAT1基因的功能已被驗證和具體闡述。DGAT2基因家族的成員在動物，植物和酵母中都存在，并且與DGAT1基因家族沒有明顯的同源性。目前對DGAT2的研究較少，僅在擬南芥(GenBank收錄號NM115011)、油菜(GenBank收錄號AY916129)、蓖麻少數(shù)植物中克隆出來。近兩年在萊茵衣藻^[19-20]和Ostreococcus?tauri^[21]中也有報道。Saha^[8]等人從發(fā)育中的花生子葉細(xì)胞質(zhì)中克隆得到了DGAT3基因，該基因與DGAT1和DGAT2基因家族的相似性不足10％，但是其編碼的蛋白具有類似DGAT蛋白功能基序，而且與TAG合成密切相關(guān)。此外，有證據(jù)表明TAG的形成還存在另外一條途徑，即由磷脂：甘油二酯脂酰轉(zhuǎn)移酶(PDAT)利用磷脂催化甘油二酯(DAG)合成TAG和溶血磷脂的反應(yīng)。無論是在植物還是微藻中，對PDAT基因的研究均不多。