[發明專利]一種提高谷氨酰胺轉胺酶熱穩定性的短肽及其應用

有效

• 申請號: 201310316129.9
• 申請日: 2013-07-25
• 公開（公告）號: CN103554223A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 陳堅;王廣圣;陳康康;劉松;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C12N9/10;C12N9/96
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及一種短肽及其應用，特別是一種提高谷氨酰胺轉氨酶熱穩定性的短肽及其應用。

背景技術

微生物谷氨酰胺轉胺酶（蛋白質-谷氨酸-谷氨酰胺轉胺酶，Microbial?Transglutaminase，EC2.3.2.13簡稱MTG）能夠催化蛋白質肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基與賴氨酸ε-酰基或其他酰基反應，形成ε-(γ-谷氨酰基)賴氨酸共價鍵。特殊的催化能力使TGase廣泛應用于食品工程、紡織與皮革加工、材料工程、生物醫藥等領域。但由于MTG異源表達分泌量低等缺陷，限制了MTG的應用范圍。

在前期研究中，本研究室篩選出一株新的產谷氨酰胺轉胺酶的菌株（Streptomyces?hygroscopicus?CCTCC?M203062），通過基因克隆方法，得到了MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的啟動子和終止子（Genebank：EU477523），并實現了MTG和其酶原區在大腸桿菌中的高效表達（Liu?S,Zhang?D,Wang?M,Cui?W,Chen?K,Liu?Y,Du?G,Chen?J,Zhou?Z?(2011)The?pro-region?of?Streptomyces?hygroscopicus?transglutaminase?affects?its?secretion?by?Escherichia?coli.FEMS?Microbiol?Lett324(2):98-105）。

谷氨酰胺轉胺酶具有重要的工業應用價值，但其熱穩定性始終是一個不可逾越的障礙，為提高TGase酶的穩定性，本發明選取該穩定短肽融合至TGase酶C端，以期得到熱穩定性提高的突變酶。

發明內容

本發明所要解決的問題是提供一種提高的谷氨酰胺轉氨酶熱穩定性的短肽，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

SEQ?ID?NO.1:短肽氨基酸序列為：IGCIILT。

本發明要解決的技術問題是提供一種熱穩定性提高的谷氨酰胺轉氨酶，其C端含有上述短肽序列，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

SEQ?ID?NO.2：谷氨酰胺轉胺酶C端加短肽序列為

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本發明要解決的另一個技術問題是提供一種應用上述短肽提高谷氨酰胺轉氨酶熱穩定性的方法，將上述短肽插入到谷氨酰胺轉胺酶C端。

谷氨酰胺轉胺酶活力的測定方法：

比色法測定酶活：以N-α-CBZ-GLN-GLY為作用底物，L-谷氨酸-γ單羥胺酸做標準曲線。1個單位谷氨酰胺轉胺酶酶活定義為：37℃時每分鐘催化形成1μmol?L-谷氨酸-γ單羥胺酸的酶量(U/mL)。

試劑A：100mg的Nα-CBZ-GLN-GLY溶解于2mL0.2moL/L的NaOH溶液中，加入0.2mol/L?pH6.0的Tris-HC緩沖液4mL，0.1mol/L羥胺2mL，0.01mol/L的還原型谷胱甘肽2mL，并調節pH至6.0。

試劑B：3mol/L的HCL，12%TCA，5%FeCL₃按1：1：1混合。