[發明專利]編碼重組豬β-防御素-1的基因及豬β-防御素-1的制備方法

無效

• 申請號: 201310315778.7
• 申請日: 2013-07-25
• 公開（公告）號: CN103387992A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發明（設計）人: 宋勤葉;程立功;樊寶良;逯紀成;陳桂清;袁洪興
• 申請（專利權）人: 河北農業大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70
• 代理公司: 石家莊國為知識產權事務所 13120
• 代理人: 李榮文

1.一種編碼重組豬β-防御素-1的基因，其特征在于：其具有SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列。

2.如權利要求1所述的一種編碼重組豬β-防御素-1的基因，其特征在于：其是通過RT-PCR方法，利用引物P1和P2從健康豬肝臟組織中擴增β-防御素-1的前體基因序列，P1具有SEQ?ID?No.2所示的核苷酸序列，P2具有SEQ?ID?No.3所示的核苷酸序列。

3.重組豬β-防御素-1的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）重組質粒pGM-T-PBD-1的構建：將權利要求1的基因與pGM-T載體連接，轉化至E.coli.?DH5α感受態細胞內，通過Amp抗性篩選，將單個陽性菌落接種到3mL?Amp⁺/LB液體培養基中，37℃搖菌過夜，克隆，提取質粒；

（2）以重組質粒pGM-T-PBD-1為模板，用引物eP1和eP2進行PCR擴增得到豬β-防御素-1成熟肽基因，eP1具有SEQ?ID?No.4所示的核苷酸序列，eP2具有SEQ?ID?No.5所示的核苷酸序列；

將所述豬β-防御素-1成熟肽基因與原核表達質粒pET-32a（+）連接，轉化至E.coli.?DH5α感受態細胞內，克隆，提取豬β-防御素-1重組表達質粒pET-32a-PBD-1；豬β-防御素-1成熟肽具有SEQ?ID?No.6所示的核苷酸序列；

（3）重組豬β-防御素-1的體外誘導表達：將鑒定正確的pET-32a-PBD-1表達質粒轉化至E.coli.?DE3感受態細胞中，涂布于Amp⁺/LB平板上，37℃過夜培養，挑選單個菌落，接種于3mL?Amp⁺/LB液體培養基，28℃搖菌過夜，然后按照1:100比例接種于Amp⁺/LB液體培養基中，28℃?200r/min搖菌培養至對數生長期，OD₆₀₀=0.6～1.0，加入終濃度為0.5?mmol/L的IPTG，28℃?200r/min?誘導培養4～6h。