[發明專利]一株產芽孢漆酶的芽孢桿菌及利用該菌產芽孢漆酶的方法

有效

• 申請號: 201310315314.6
• 申請日: 2013-07-25
• 公開（公告）號: CN103421709A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 汪春蕾;李凡姝;趙敏;崔岱宗;盧磊;李德斌;王天女;陶雷
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/02;C12R1/07
• 代理公司: 哈爾濱市偉晨專利代理事務所(普通合伙) 23209
• 代理人: 張偉

技術領域

本發明涉及一株芽孢桿菌及利用該菌產芽孢漆酶的方法。

背景技術

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，它可利用活性中心的銅離子催化氧化多種結構的芳香化合物，同時將分子氧還原成水。由于漆酶催化的底物范圍十分廣泛，因此漆酶已被廣泛應用于造紙工業、紡織工業、食品工業以及土壤的生物修復等領域。

漆酶催化氧化底物一般包括兩種作用方式，第一種是底物分子直接與漆酶銅簇反應氧化成相應的激發態分子。然而有些底物不能有漆酶直接氧化，原因在于它們分子太大而不能滲透進入酶的活性部位，或者由于其氧化還原電位較高而不能被漆酶直接氧化。漆酶氧化底物的第二種方式是通過一些小分子的介體物質為媒介，漆酶先將小分子介體氧化成激發態，然后這些激發態的介體再與大分子的或氧化還原電位較高的底物反應，該方式也被成為漆酶—介體系統（LMS）。漆酶—介體系統的應用有助于進一步擴大漆酶的底物范圍，提高漆酶的工業應用范圍。

在自然界中，漆酶廣泛分布于植物、真菌和細菌中，特別是真菌，是目前漆酶的主要生產者。雖然目前對細菌漆酶的理論研究不如真菌漆酶深入，但細菌具有生長快、易于培養的特點，細菌漆酶較真菌漆酶在堿性環境和高溫下具有更好的穩定性。由于工業造紙廢水等一般溫度較高，堿性較強，真菌漆酶在實際應用中受到穩定性的限制，因此細菌漆酶在工業上具有更好的應用前景。

染料被廣泛應用于紡織、印染、皮革等行業，全球每年生產染料萬種之余，至少有10%–15%的染料通過廢水排放到自然環境中，對水體的生態環境造成嚴重破壞。工業使用的合成染料多是芳香族化合物，結構復雜，難降解。目前染料廢水的處理反復主要有物理化學法和生物處理法，物化處理技術費用高，存在二次污染；生物法因其經濟環保而成為較好的治理方法。其中漆酶由于具有廣泛的底物作用范圍，可催化降解多種結構的染料在工業染料廢水處理上具有較好地應用前景。已有很多關于應用白腐真菌或其他真菌來源的漆酶脫色染料的研究，但關于細菌漆酶以及細菌漆酶-介體系統在染料脫色方面的研究報道較少。通過研究細菌漆酶對不同合成染料的脫色效果，可以進一步推動細菌漆酶的工業應用。

發明內容

本發明提供一株產芽孢漆酶的芽孢桿菌及利用該菌產芽孢漆酶的方法，該菌株可產芽孢漆酶，所產的芽孢漆酶對不同化學結構的工業合成染料具有較好的脫色作用。

本發明產芽孢漆酶的芽孢桿菌為芽孢桿菌（Bacillus?sp.）CLb，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2013年6月8日，保藏號為CGMCC?No.7683；本發明芽孢桿菌CLb革蘭氏染色陽性，細胞大小為（1μm～2μm）×（5μm～7μm），具有側鞭毛和莢膜；在固體LB培養基上37℃培養24h，菌落乳白色、扁平、呈圓形，菌落表面干燥、光滑，菌落邊緣呈葉狀，菌落不透明且正反顏色一致。

本發明芽孢桿菌CLb?V-P試驗呈陽性，甲基紅試驗呈陽性，硝酸鹽還原試驗呈陽性，丙二酸鹽試驗呈陽性。芽孢桿菌CLb可利用麥芽糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露醇、肌醇醇、山梨醇、密二糖和乳糖；芽孢桿菌CLb具有明膠液化酶、脂肪酶、氧化酶、過氧化氫酶、蛋白酶和尿素酶。

本發明芽孢桿菌CLb可在LB培養基上生長，最適生長溫度為37℃，最適生長pH為7.0。

本發明芽孢桿菌（Bacillus?sp.）CLb通過16S?rDNA序列比對分析，與芽孢桿菌屬（Bacillus）的親緣關系最為接近，保守區相似性為95%。通過結合菌體形態特征、生長條件確定芽孢桿菌CLb為芽孢桿菌屬（Bacillus）的一株新菌株，命名為芽孢桿菌CLb。

本發明芽孢桿菌CLb能夠產芽孢漆酶，所產的芽孢漆酶對不同化學結構的工業合成染料具有較好的脫色作用。在介體乙酰丁香酮的參與下，在pH7.0時對RBBR（雷馬素艷藍R）、活性黑KN-B、靛紅和結晶紫6h后的脫色率分別為79.13%、91.83%、94.67%和92.5%。

利用上述芽孢桿菌CLb產芽孢漆酶的方法，按以下步驟進行：

一、將芽孢桿菌CLb劃線接種于固體產孢培養基上，37℃倒置培養5d；

二、然后用無菌去離子水將固體產孢培養基上的芽孢沖洗下來，加入終濃度為0.1mg/mL的溶菌酶，37℃水浴10min；

三、然后依次用含有10mmol/L?EDTA的1mol/L?NaCl溶液、0.14mol/L?NaCl溶液和質量濃度為0.1%的SDS分別清洗芽孢一遍；

四、再用無菌去離子水清洗芽孢一遍；