[發明專利]基于修飾電極的酪氨酸酶生物傳感器及制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310314564.8
• 申請日: 2013-07-24
• 公開（公告）號: CN103389328A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發明（設計）人: 周耀渝;湯琳;曾光明;陳俊;章毅;楊貴德;蔡葉;方艷;王佳佳;張盛
• 申請（專利權）人: 湖南大學
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26;G01N27/327;C04B41/50
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所 43008
• 代理人: 趙洪

技術領域

本發明涉及一種生物傳感器及其制備方法和應用，尤其涉及一種酪氨酸酶生物傳感器及其制備方法和應用。

背景技術

苯酚和鄰苯二酚等酚類化合物因其具有高毒性和難于降解而污染環境、危害人體健康。苯酚和鄰苯二酚在環境中廣泛存在，是重要的有機化工原料，在化妝品、染料、制藥、農藥等行業廣泛運用；另外，在生物修復過程中，比如堆肥，含苯氧基的化合物、芳香族化合物降解也會直接或間接的產生此類污染物，隨著固體廢棄物處置中堆肥技術的應用越來越廣泛，研究快速、方便且準確測定苯酚和鄰苯二酚含量的檢測方法具有重要意義。

目前，苯酚、鄰苯二酚等有機污染物的主要測定方法有色譜法、紫外分光法、同步熒光光譜法、分光光度法、導數光度法、流動注射分析法等，但是，這些方法都存在前處理復雜、耗時長、樣品基體效應大、分析周期長等缺陷，對工作人員的操作水平要求高、儀器昂貴，且不便攜帶，不能進行實時檢測，很難在中小型企業中推廣應用。

生物傳感器是基于生物有機成分（如酶、抗體、核酸、細胞、微生物等），對待測物質進行專一的識別，產生的信號經過信號傳導器轉變為電信號或光信號，進而定量檢測出待測物質的一項新技術。運用生物傳感器來檢測環境中的重金屬、病原微生物、有毒有機物時，生物傳感器具有特異性強、檢測靈敏度高、檢測效率高、成本低廉的特點，因此成為了環境保護工作中的一個研究熱點。

目前，科研人員正努力提高生物傳感器的穩定性、重復性、結構的可靠性以及實用性，其中，利用各種新型材料固定生物敏感元件并保持活性是發展生物傳感器的一個重要方向。制作生物酶傳感器的關鍵是如何高效地固定酶，并保持酶的活性，常用的酶固定方法有：吸附固定法、包埋固定法、共價固定法和交聯固定法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種制作簡單、使用壽命長、酶活性高、檢測精度和效率高的基于修飾電極的酪氨酸酶生物傳感器，還相應提供一種成本低廉、操作簡單、制作快速的酪氨酸酶生物傳感器的制備方法，使酪氨酸酶的固定具有更好的穩定性和高活性的保持，在此基礎上，還提供一種前述酪氨酸酶生物傳感器的應用，該應用能夠以低成本、簡化操作、快速響應、高檢測精度及較強抗干擾性等特點實現對苯酚和鄰苯二酚兩種物質的高效檢測。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為一種基于修飾電極的酪氨酸酶生物傳感器，所述生物傳感器包括一玻碳電極，所述玻碳電極的檢測端表面沉積有L-半胱氨酸修飾的氮雜化介孔碳，所述L-半胱氨酸修飾的氮雜化介孔碳上通過戊二醛固定有酪氨酸酶（戊二醛起交聯作用，通過氨基-醛基鍵作用于酪氨酸酶和L-半胱氨酸修飾的氮雜化介孔碳上）。

作為一個總的技術構思，本發明還提供一種上述基于修飾電極的酪氨酸酶生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

（1）修飾氮雜化介孔碳：向一玻碳電極的檢測端表面用電化學方法沉積L-半胱氨酸溶液（溶劑通常為水），得到L-半胱氨酸修飾電極，晾干備用；將準備好的氮雜化介孔碳懸浮液（以N,N-二甲基甲酰胺作為分散劑）滴加到L-半胱氨酸修飾電極的檢測端表面上，得到L-半胱氨酸修飾的氮雜化介孔碳電極；

（2）交聯戊二醛：將步驟（1）制得的L-半胱氨酸修飾的氮雜化介孔碳電極的檢測端于室溫下（一般為25℃～35℃）浸入配制好的戊二醛溶液中，得到復合材料修飾電極，晾干備用；

（3）固定酪氨酸酶（tyrosinase）：在步驟（2）得到的復合材料修飾電極的檢測端表面滴加配制好的酪氨酸酶溶液，通過戊二醛的交聯作用使酪氨酸酶固定于復合材料修飾電極上，得到酪氨酸酶生物傳感器。

所述步驟（1）中，所述L-半胱氨酸溶液的濃度優選1.0×10^-3mol/L～1.0×10^-2mol/L；所述氮雜化介孔碳懸浮液的濃度優選1.0mg/mL～3.0mg/mL，所述L-半胱氨酸修飾電極的檢測端表面優選滴加5μL～10μL的氮雜化介孔碳懸浮液。

所述步驟（2）中，所述戊二醛溶液中戊二醛的質量分數優選1%～3%，所述L-半胱氨酸修飾氮雜化介孔碳電極在戊二醛溶液中浸入的時間優選30min～60min。

所述步驟（3）中，所述酪氨酸酶溶液的pH值為4.5～9.2，所述酪氨酸酶溶液中酪氨酸酶的濃度為0.05mg/μL～0.1mg/μL。

所述氮雜化介孔碳是采用包括以下步驟的制備方法制得：