[發(fā)明專利]一種斑點(diǎn)叉尾鮰物種鑒定試劑盒及其使用方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310313697.3
• 申請(qǐng)日: 2013-07-24
• 公開（公告）號(hào): CN103409515A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅志萍;吳志毅;趙文軍;段勝男
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 羅志萍
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京輕創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11212
• 代理人: 楊立

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種試劑盒及其使用方法，尤其涉及一種斑點(diǎn)叉尾鮰物種鑒定試劑盒及其使用方法，屬于分子生物學(xué)PCR遺傳鑒定領(lǐng)域。

背景技術(shù)

斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus?punctatus），亦稱溝鯰（Channel?Catfish），屬鯰形目（Siluriformes）、鮰科（Ictaluridae）、叉尾鮰屬（Ictalurus）。它原產(chǎn)于北美，其自然分布區(qū)在美國(guó)中部、加拿大南部和墨西哥北部。斑點(diǎn)叉尾鮰屬名貴淡水經(jīng)濟(jì)魚類，深受美國(guó)、加拿大及其它許多國(guó)家消費(fèi)者的喜愛。加工好的成品或半成品在美國(guó)、日本、歐洲和加拿大等地市場(chǎng)均很暢銷，市場(chǎng)需求量極大。自1984年，我國(guó)湖北省水產(chǎn)研究所首次引進(jìn)斑點(diǎn)叉尾鮰，隨著繁育、養(yǎng)殖以及加工技術(shù)的日趨成熟，再加上高額的投資回報(bào)效益，使得斑點(diǎn)叉尾鮰的養(yǎng)殖業(yè)和加工業(yè)在我國(guó)迅速蓬勃發(fā)展，出口創(chuàng)匯效益也逐年攀升。

近年來，曾被美國(guó)政府視為“反傾銷”而遭封殺的越南巴沙魚貼著“中國(guó)斑點(diǎn)叉尾鮰”的標(biāo)簽進(jìn)入美國(guó)市場(chǎng)，這不但嚴(yán)重?fù)p害我國(guó)斑點(diǎn)叉尾鮰的品牌，影響了我國(guó)斑點(diǎn)叉尾鮰產(chǎn)品的正常出口，而且擾亂了國(guó)際斑點(diǎn)叉尾鮰市場(chǎng)，我國(guó)出口企業(yè)因被美國(guó)以物種不符為由多次退貨遭受巨大經(jīng)濟(jì)損失。作為主要依托科技手段保障經(jīng)貿(mào)發(fā)展的出入境檢驗(yàn)檢疫部門也已經(jīng)面臨一項(xiàng)全新的任務(wù)和挑戰(zhàn)。

對(duì)于已加工好的斑點(diǎn)叉尾鮰成品和半成品，由于形態(tài)已發(fā)生完全改變，主要依據(jù)骨骼結(jié)構(gòu)和外部形態(tài)特征的傳統(tǒng)物種鑒定方法在斑點(diǎn)叉尾鮰的物種鑒定上已完全不適用。此外，在成品和半成品中，由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞和蛋白質(zhì)的嚴(yán)重變性，依據(jù)染色體特征的細(xì)胞分類學(xué)方法以及依據(jù)同功酶數(shù)據(jù)的酶學(xué)鑒定方法等也同樣不適合斑點(diǎn)叉尾鮰的物種鑒定。

隨著PCR技術(shù)和DNA測(cè)序技術(shù)的日趨成熟，通過DNA序列信息了解物種之間的遺傳分化變得越來越普遍。線粒體DNA以其進(jìn)化速率快，遵循母系遺傳等特點(diǎn)，成為種群遺傳學(xué)研究的有效標(biāo)記之一。有關(guān)科技查新結(jié)果表明，國(guó)外已有線粒體DNA的PCR-RFLP的數(shù)據(jù)進(jìn)行鱈魚、比目魚等制品中物種鑒定的報(bào)道，但均沒有線粒體DNA的D-loop區(qū)的分子數(shù)據(jù)來進(jìn)行斑點(diǎn)叉尾鮰物種鑒定方面的報(bào)道。而且PCR-RFLP方法操作過程繁瑣，多用于對(duì)同一物種的不同群體進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，不適于快速、經(jīng)濟(jì)的鑒定斑點(diǎn)叉尾鮰物種。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種斑點(diǎn)叉尾鮰物種鑒定試劑盒及其使用方法，解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，利用已加工好的斑點(diǎn)叉尾鮰成品和半成品，快捷方便的鑒別出斑點(diǎn)叉尾鮰物種。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種斑點(diǎn)叉尾鮰物種鑒定試劑盒，包括以下分離包裝的試劑：裂解液、抽取液Ⅰ、抽取液Ⅱ、PCR反應(yīng)液、酶切反應(yīng)液、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照；

所述裂解液PH值為8，包括以下組分：200mmol/L?NaCl、20mmol/LTris-HCl、50mmol/L?EDTA、1%SDS，其余為水；

所述抽取液Ⅰ包括苯酚、氯仿和異戊醇，其中苯酚、氯仿與異戊醇的體積比為25:24:1；

所述抽取液Ⅱ包括氯仿和異戊醇，其中氯仿與異戊醇的體積比為24:1；

所述PCR反應(yīng)液包括以下組分：10×PCR?Buffer、MgCl₂、dNTPs、上游引物、下游引物、Taq?DNA聚合酶，其余為超純水；具體引物序列為：

上游引物：5’-GTCGCCTCCGTACTGTATTTCTCC-3’，

下游引物：5’-GGGTCCATCTTAACATCTTCAGTG-3’；

所述酶切反應(yīng)液包括10×Buffer和EcoR?Ⅰ；

所述陽性對(duì)照為PCR擴(kuò)增后已酶切鑒定過的斑點(diǎn)叉尾鮰D-loop標(biāo)準(zhǔn)樣品（即已知的斑點(diǎn)叉尾鮰物種D-loop進(jìn)行PCR擴(kuò)增和酶切之后得到的產(chǎn)物結(jié)果）；

所述陰性對(duì)照為PCR擴(kuò)增后未酶切的斑點(diǎn)叉尾鮰D-loop標(biāo)準(zhǔn)樣品（即已知的斑點(diǎn)叉尾鮰物種D-loop進(jìn)行PCR擴(kuò)增不進(jìn)行酶切得到的產(chǎn)物結(jié)果）。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。

進(jìn)一步，所述PCR反應(yīng)液中，含有10×PCR?Buffer2.5μl、MgCl₂2.0μl、dNTPs2.0μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、Taq?DNA聚合酶0.5μl，以及超純水16μl。

進(jìn)一步，所述酶切反應(yīng)液中，含有10×Buffer2.0μl和EcoRⅠ1.0μl。