[發明專利]懸鉤子環斑病毒RT-PCR檢測引物及檢測方法

有效

• 申請號: 201310313071.2
• 申請日: 2013-07-24
• 公開（公告）號: CN103409557A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 黃天培;吳媛;方志鵬;廖富榮;關雄
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種懸鉤子環斑病毒RT-PCR檢測引物，其特征在于由1對寡核苷酸引物RpRSV-F1和RpRSV-R1組成，序列如下：

RpRSV-F1：?5’-TCAGCGGTACTGTTAAATGTC-3’

RpRSV-R1：?5’-CTAAAGGCACAACCTCAAAGA-3’。

2.一種利用權利要求1的引物檢測懸鉤子環斑病毒的RT-PCR方法，包括以樣品總RNA為模板，進行RT-PCR擴增和RT-PCR產物電泳檢測，其特征在于：

（1）RT-PCR擴增：

第一步合成cDNA，在0.5?mL反應管中，加入6?μL總RNA，2?μL?10?μmol/L的下游引物RpRSV-R1，95℃水浴10?min，冰浴5?min，然后繼續加入4?μL?2.5mmol/L的dNTPs，5?μL?5×?Reaction?buffer，0.5?μL?40?U/μL的Recombinant?RNasin?Ribonuclease?Inhibitor，0.5?μL?200?U/μL?的M-MLV?Reverse?transcriptase，7μL滅菌水，混勻后37℃水浴60?min，75℃水浴15?min，合成cDNA；

第二步進行PCR擴增，PCR反應體系為25?μL，包括13.25μL滅菌水，2.5?μL?10×?PCR?buffer，2?μL?dNTPs，2?μL上游引物RpRSV-F1，2μL下游引物RpRSV-R1，3?μL?cDNA，0.25?μL?Ex?Taq?DNA聚合酶，混勻后于PTC-200?PCR儀上進行擴增；反應參數為94℃?3?min；94℃?50?s，58℃?50?s，72℃?50?s，35個循環；72℃延伸10?min；

（2）RT-PCR產物電泳檢測：

RT-PCR反應結束后，取3μL擴增產物進行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統上觀察結果：在222bp處未出現特異性基因條帶的樣品，表示該樣品不含有RpRSV；在222bp處出現基因條帶的樣品，表示該樣品含有RpRSV。

3.一種如權利要求1所述的引物在檢測懸鉤子環斑病毒上的應用。