[發明專利]一種菲律賓蛤仔酶解物在抗肺癌中的應用

在審

• 申請號: 201310312796.X
• 申請日: 2013-07-23
• 公開（公告）號: CN104337837A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發明（設計）人: 楊最素;丁國芳;孫瑜;徐律;黃芳芳;郁迪;閆海強
• 申請（專利權）人: 浙江海洋學院
• 主分類號: A61K35/618
• 分類號: A61K35/618;A61P35/00
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 袁忠衛

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，尤其涉及一種菲律賓蛤仔酶解物在抗肺癌中的應用。

背景技術

菲律賓蛤仔（Ruditapes?philippinarum）屬軟體動物門雙殼綱簾蛤目簾蛤科，一種廣溫性的小型雙殼貝類，南方俗稱花蛤，與牡蠣、縊蟶、蚶類并列為我國四大養殖貝類，是近岸灘涂和淺海的主要貝類之一，其味道鮮美，營養豐富，蛋白含量高。

癌癥，亦稱惡性腫瘤，是一種通過控制細胞生長增殖機制失常而引起的疾病。肺癌是當今人類的高發癌，居癌癥之首，非小細胞肺癌的患病率約占肺癌總發病數的80%，約2/3的患者在確診時已失去手術機會，放、化療在非小細胞肺癌治療中占有重要地位，但放、化療的毒副作用嚴重影響著治療效果和生活質量。近年來對菲律賓蛤仔提取物的抗腫瘤研究有了很大的進展，如范秀萍等（食品工業科技，2003）利用菲律賓蛤仔糖胺聚糖的粗制品（CRG）作用于體外培養的HL-60細胞，發現CRG在1.0mg/ml濃度下對HL-60細胞具有顯著抑制作用，在24h、48h、72h抑瘤率分別可達59.8%、67.7%和96.2%。張莉等（海洋與湖沼，2007）利用菲律賓蛤仔肉提取兩種蛋白聚糖PG1和PG2，其中PG1在200ug/ml濃度時對人肝癌細胞SMMC7721的生長抑制率達到73.30%，且不影響人正常肝細胞HL-7002的生長與功能。從海洋生物中提取抗腫瘤活性物質是科學界研究的熱點，其中抗癌肽尤為引人注目。利用蛋白酶酶解獲得生物活性肽是一種安全性高，產率高的方法，近年來研究發現菲律賓蛤仔酶解物具有多種生物活性，如楊永芳等（中華中醫藥學刊，2011）利用菲律賓蛤仔酶解寡肽對羥自由基的清除作用來考查各酶解物的抗氧化活性，結果發現在酶解物濃度為2.5mg/ml時的羥自由基清除率、DPPH自由基清除率和還原力均高于Vit?C。目前，關于菲律賓蛤仔酶解物的抗癌性，尤其在抗肺癌中的應用目前還未見報道，因此具有進一步研究的空間。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術而提供一種菲律賓酶解物的新用途，即在抗肺癌中的應用。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種菲律賓蛤仔酶解物在抗肺癌中的應用。

肺癌中非小細胞肺癌占肺癌總數的80%，是最常見的肺癌，作為優選，上述方案中的肺癌指非小細胞肺癌。

上述方案中菲律賓蛤仔酶解物的分子量小于3KDa，其通過以下方法制得：

1）新鮮的菲律賓蛤仔洗凈后，取肉、去雜質，使用組織搗碎機搗碎勻漿；

2）在步驟1）中所得勻漿液中加入1200u/g胰蛋白酶，酶解24h，酶解溫度為37℃，酶解pH為8.0；

3）酶解反應結束后，90℃滅酶15min，然后在4℃下8500r/min離心15min，取上清；

4）采用截取分子量為3KDa的超濾膜，20℃超濾11h獲得酶解液；

5）將步驟4）所得的酶解液旋轉蒸發后，冷凍干燥保存，實驗時用F12培養液配成不同的濃度。

為更好地理解本發明的實質，本發明中菲律賓蛤仔酶解物作用于體外培養的人肺癌H1299細胞株，將酶解物作用后的H1299細胞分別進行MTT檢測、HE染色和AO/EB染色，其中，MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法；HE染色，即蘇木精-伊紅染色法，是一種普通光學顯微鏡觀察與鑒別細胞凋亡與細胞壞死的染色方法；AO/EB染色，即吖啶橙/溴化乙錠雙熒光染色，是一種檢測細胞培養中凋亡細胞形態以及數量的方法。結果顯示該菲律賓蛤仔酶解物能顯著抑制H1299細胞生長，且隨酶解物反應液濃度增加和作用時間的延長，抑制率明顯上升；倒置顯微鏡和HE染色對照組的H1299細胞呈上皮樣生長，形態基本一致，伸展性好，經酶解物作用后，細胞形態發生改變，胞質內出現空泡，核染色質邊聚，核固縮等凋亡的形態學改變，因此菲律賓蛤仔酶解物能顯著抑制H1299細胞的增殖并能誘導H1299細胞凋亡。

與現有技術相比，本發明的優點在于：

1、本發明中菲律賓蛤仔酶解物抑制H1299細胞增殖，誘導其凋亡效果顯著。本發明中30mg/ml酶解物作用H1299細胞48h后，培養容器中形態正常的H1299細胞明顯減少，漂浮細胞或漂浮物明顯增加，細胞出現增殖抑制并死亡的現象。

2、本發明中酶解物原料來源廣泛，制備過程操作簡單、效率高、安全性高。菲律賓蛤仔是一種在我國海域中在近岸灘涂和淺海中常見的貝類海產品，在沿海的菜市場、超市等處十分常見，同時利用胰蛋白酶的特異性和高效性制備酶解物，使得酶解物的制備簡單、高效、安全。

附圖說明