[發明專利]生產丁二酸的重組質粒、基因工程菌的構建及用途

有效

• 申請號: 201310312492.3
• 申請日: 2013-07-15
• 公開（公告）號: CN104293817B
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發明（設計）人: 王丹;王競;王洪輝;汪楠;周小華
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N1/21;C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種重組質粒，其特征在于，該重組質粒攜帶完整的大腸桿菌MgtA基因的片段，即該重組質粒是攜帶有序列表中SEQ ID NO：2所示的DNA片段的pTrchisA載體。

2.一種琥珀酸高產、低成本基因工程菌DYCMG111，其特征在于：所述工程菌是通過將權利要求1所述的重組質粒轉入起始菌DC1515中而得到的。

3.權利要求1的重組質粒的構建方法，其特征在于，(1)首先設計引物：mgtA up：-5’GGAGGGACTCCTTATGTTTAA3’-，mgtA down：-5’GCTATCGTGCCCAGTTTAT3’-；以大腸桿菌的總DNA為模板，進行PCR擴增，得到一個長度為2820bp的片段，經測序證實其為序列表中SEQ ID NO：1的DNA片段；純化PCR產物，連接到pMD19-T載體，得到質粒pMD-mgtA1；(2)利用設計的引物pTrchisA-mgtA up：-5’CGATTCGGATCCCTCCTT3’-，劃線處為BamHI酶切位點；pTrchisA-mgtA down：-5’CGTACCCGGAAGCTTTCTAGAGA3’-，劃線處為HindIII酶切位點；以質粒pMD-mgtA1為模板，進行PCR擴增，得到一個長度為2767bp的片段，經測序證實其為序列表中SEQ ID NO：2的DNA片段，含有大腸桿菌鎂離子轉運蛋白MgtA基因編碼序列，連接到pMD19-T載體，得到質粒pMD-mgtA2；(3)將pMD-mgtA2質粒與pTrchisA質粒分別用BamHI和HindIII雙酶切，將序列表中SEQ ID NO：2的DNA片段插入質粒pTrchisA的酶切位點處，構建出所述重組質粒。

4.權利要求2的琥珀酸高產、低成本基因工程菌DYCMG111的制備方法，其特征在于，權利要求1的重組質粒轉入起始菌DC1515中，得到所述基因工程菌DYCMG111。

5.權利要求1中的重組質粒或權利要求2的琥珀酸高產、低成本基因工程菌DYCMG111在制備用于基因工程發酵生產丁二酸的生物產品中的應用。

6.使用權利要求2的琥珀酸高產、低成本基因工程菌DYCMG111發酵葡萄糖生產丁二酸的方法，其特征在于：所述方法包括在生長過程中生物量的積累及加入不同的誘導劑時，在雙階段發酵生產丁二酸。