[發(fā)明專利]一種枯草芽孢桿菌的微生物制劑制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310311377.4
• 申請(qǐng)日: 2013-07-23
• 公開（公告）號(hào): CN103352020A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓青梅;陳亞菲;高小寧;黃麗麗;秦虎強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N11/14;C12N11/12;A01N63/00;A01P3/00;C12R1/125
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一株枯草芽孢桿菌、其微生物制劑的制備方法以及將其應(yīng)用于防治油菜菌核病。?

背景技術(shù)

油菜菌核病是由核盤菌（Sclerotinia?sclerotiorum（Lib.)de?Bary）引起的一種真菌病害，在世界上各個(gè)油菜主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。在我國(guó)主要油菜產(chǎn)區(qū)中，油菜菌核病作為一種常發(fā)性病害，居油菜三大病害（霜霉病、病毒病）之首，發(fā)病率一般為10～30%，嚴(yán)重年份可達(dá)80%以上，減產(chǎn)11%～73%，含油量降低1%～5%，致使油菜的品質(zhì)和產(chǎn)量大大減小。由于菌核病菌喜歡潮濕溫潤(rùn)的環(huán)境，因此在長(zhǎng)江中、下游及東南沿海等主要的油菜產(chǎn)區(qū)，包括江蘇、安徽、上海、浙江、湖南、湖北、江西等地發(fā)生尤為突出，嚴(yán)重影響了我國(guó)的油菜生產(chǎn)。?

目前，對(duì)于油菜菌核病的防治主要采用選用抗病品種及藥劑防治為主的綜合防治措施。然而由于油菜對(duì)菌核病抗性遺傳的復(fù)雜性，目前并沒(méi)有獲得對(duì)菌核病免疫的油菜品種。同時(shí)化學(xué)防治主要采取對(duì)地上部噴施化學(xué)藥劑，由于花期油菜自身植株比較高大，花期時(shí)間較長(zhǎng)等特性，化學(xué)防治的防治效果并不穩(wěn)定，而且長(zhǎng)期使用農(nóng)藥，不但會(huì)污染環(huán)境，危害人類健康，而且不斷導(dǎo)致核盤菌群體中抗藥性菌株的出現(xiàn)，因此利用有益微生物對(duì)菌核病的生物防治已經(jīng)成為現(xiàn)在的研究?熱點(diǎn)。?

目前國(guó)內(nèi)外研究已發(fā)現(xiàn)多種真菌、細(xì)菌或其它微生物對(duì)核盤菌具有寄生或拮抗作用，而且已經(jīng)有商品制劑應(yīng)用于生產(chǎn)，但是至今仍存在一些亟待解決的問(wèn)題。首先，目前開發(fā)的生防資源易受外界條件的影響，不容易在植物體內(nèi)定殖，防治效果不穩(wěn)定。其次，生防菌發(fā)酵液不易儲(chǔ)存和運(yùn)輸，在使用過(guò)程中，制發(fā)酵液繁瑣，不易操縱，不利于進(jìn)一步推廣應(yīng)用。?

植物內(nèi)生菌是一種能在植物組織中定殖與運(yùn)轉(zhuǎn)，對(duì)植物無(wú)害甚至有益的微生物，由于它在植物體內(nèi)有穩(wěn)定的生存空間，且能產(chǎn)生與宿主植物代謝相同或相似的生理活性物質(zhì)，因而能有效地抑制病原菌的侵染或提高宿主植物的抗病性。近幾年，內(nèi)生菌因其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)成為生物防治的研究熱點(diǎn)，為生物防治的應(yīng)用開辟了新的天地。?

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明將提供一種微生物制劑，其主要成份為一株植物內(nèi)生細(xì)菌—枯草芽孢桿菌（Bacillus?sp.）EDR4，以及其制備方法與防治油菜菌核病的應(yīng)用。?

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：?

本發(fā)明菌株分離自我國(guó)陜西省田間自然生長(zhǎng)的小麥根部，經(jīng)菌落和形態(tài)的顯微觀察、染色反應(yīng)、常規(guī)生理生化特性實(shí)驗(yàn)以及16s?rDNA序列分析，該菌株鑒定為芽孢桿菌的一個(gè)新菌株，命名為枯草芽孢桿菌（Bacillus?sp.）EDR4。?

本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌（Bacillus?sp.）EDR4已于2007年08月16日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC?No.2133。保藏期限30年，30年內(nèi)免費(fèi)提供活菌。?

本發(fā)明所制備的微生物制劑中的活性成份為保藏編號(hào)CGMCC?No.2133的枯草芽孢桿菌（Bacillus?sp.）EDR4。?

制備具有保藏編號(hào)CGMCC?No.2133的枯草芽孢桿菌（Bacillus?sp.）EDR4活性成份的微生物制劑方法如下：?

將-80℃下保存的保藏編號(hào)為CGMCC?No.2133的枯草芽孢桿菌（Bacillus?sp.）菌株在LB固體培養(yǎng)基上活化，挑取枯草芽孢桿菌（Bacillus?sp.）EDR4單菌落，接種于100mL的LB培養(yǎng)液（250mL三角瓶），于28℃、150rpm振蕩培養(yǎng)18～24h，然后按照1%的種子液接種到100mL的LB培養(yǎng)液中，于28℃、150rpm振蕩培養(yǎng)48h，或者按照1%的種子液接種玉米粉固體培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)48h。將得到的發(fā)酵液與載體物質(zhì)混合后獲得微生物制劑。?

需要說(shuō)明的是，LB培養(yǎng)液由10g蛋白胨、10g酵母粉、5gNaCl、1000mL蒸餾水組成，其pH值為7.2。?

需要說(shuō)明的是，所述的玉米粉培養(yǎng)基含有玉米粉50g，黃豆粉35g，麩皮40g，蒸餾水1000mL。?

需要說(shuō)明的是，所述的載體物質(zhì)主要為硅藻土。作為一種優(yōu)選的方案，發(fā)酵后可以加入1%含量的羧甲基纖維素鈉增加粘稠度。?

需要進(jìn)一步說(shuō)明的是，所述本發(fā)明的微生物制劑為白色粉末狀，?無(wú)結(jié)塊等現(xiàn)象，其中枯草芽孢桿菌（Bacillus?sp.）EDR4的活菌數(shù)量可達(dá)1.0×10⁸CFU/g。?