[發明專利]一種海洋交替假單胞菌的發酵培養方法

有效

• 申請號: 201310310852.6
• 申請日: 2013-07-23
• 公開（公告）號: CN103409345A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 陳抗;王君;范延輝;姚志剛;付榮強;王惠
• 申請（專利權）人: 山東恩康藥業有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

技術領域

本發明涉及一種海洋交替假單胞菌的發酵培養方法，特別涉及一種魚用細菌疫苗海洋交替假單胞菌優化發酵條件后的發酵培養方法，屬于微生物發酵技術領域。

背景技術

早在1942年，Duff首次應用滅活的殺鮭產氣單胞菌口服免疫硬頭鱒獲得成功。雖然該實驗未能被后人重復證實，但畢竟開創了疫苗在魚類應用上的新紀元。此后許多人探索性的研究、制備疫苗，對那些爆發性和難以用藥物防治的魚病進行免疫預防。其中弧菌病菌苗、腸道性紅嘴病（ERM）菌苗等獲得了成功。1975年，美國疫苗有限公司（AVL）開始生產商品型魚用疫苗。1984年2月，首次魚用疫苗接種研討會在法國巴黎舉行。這次會議是魚用疫苗發展史上的一個重要里程碑。從此，新技術、新方法逐漸被用于病毒病疫苗、高效價菌苗的研制。

我國對魚類疫苗研究起步較晚，始于1955年，進展較慢。其中，草魚出血癥疫苗的研制代表了我國水產疫苗從低級向高級發展的歷史歷程。經過30余年的發展，針對草魚出血癥先后研制出4種開創性疫苗。經過實驗探索、生產應用，魚類疫苗的研究已進入用新技術和新方法研制高效疫苗的時期。到目前為止，我國獲得國家新獸醫證書的水產疫苗產品僅有三種，分別是草魚出血病細胞滅活疫苗、魚嗜水氣單胞菌敗血癥滅活疫苗和牙鲆溶藻弧菌、鰻弧菌、遲緩愛德華菌病多聯抗獨特型抗體疫苗，同發達國家相比有較大差距。此外，迄今為止尚有許多魚類疾病的病原菌還不能分離培養并鑒定；有些魚類的病原菌還不能被直接滅活制成疫苗；這些導致我國水產疫苗的研制發展緩慢，每年的魚類病害造成的損失巨大。

魚用疫苗在防病效果上具有不可替代性的優點。首先，魚用疫苗能有效地保護環境和食用魚的品質，安全的魚用疫苗使用后沒有污染，在魚體內沒有殘留，不會對魚體產生耐藥性；其次，對有些難以用藥物防治的魚病，使用魚用疫苗是有效的方法之一；再次，隨著養殖的強化，大水面魚病的暴發呈上升趨勢，從經濟的角度考慮，應用魚用疫苗免疫預防是一個有效的措施；最后隨著研究的深入，聯苗、多價疫苗以及基因工程疫苗的應用，它們的防病效果將會大大超過化學藥品等其它防治措施，提高經濟效益。

海洋細菌交替假單胞菌(Pseudoalteromonas?sp.)分離自海洋，由于其具有殺滅鰻弧菌等引起水產養殖動物疾病的病原菌，因此被廣泛的研究利用于魚用疫苗的研制工作中。

中國專利文獻CN102266356A（申請號201110215570.9）公開了一種微生物殺菌劑的制備方法，屬微生物發酵工業領域。本發明公開了一種利用假交替單胞菌(Pseudoalteromonas?sp.)制備鰻弧菌殺菌劑的方法，由(1)菌種的斜面活化培養，(2)液體發酵培養，(3)發酵液粗提，(4)抑菌劑的制備等步驟組成。

目前,假交替單胞菌的培養發酵主要為2216E培養基、Zobel2216E培養基或EM培養基等海水培養基。如中國專利文獻CN102942516A（申請號201210437136.X）公開了將假交替單胞菌保藏號為CGMCC?No.6555劃線接種到固體斜面培養基上，于30℃，培養1天后，接種1個菌落到EM培養基中，于30℃，150rpm下搖床培養7天，獲得發酵產物的步驟。

上述海水培養基是為了模擬假交替單胞菌的生存環境，從而有利于其生長。但上述培養條件由于培養速度慢，已無法適應大規模工業化生產的需要。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，本發明提供一種海洋細菌交替假單胞菌的發酵培養方法。

術語說明

海洋交替假單胞菌：生長于海洋中的交替假單胞菌（Pseudoalteromonas）。

本發明的技術方案如下：

一種海洋交替假單胞菌的發酵培養方法，步驟如下：

取活化后的海洋交替假單胞菌，按重量百分比1.0%～5.0%接種于低鹽發酵培養基中，在發酵溫度20℃～40℃、轉速120～260r/min，裝液體積百分比10%～30%，發酵培養15～28h，即可；

上述低鹽發酵培養基每升組分如下：

蛋白胨5～50g、酵母浸粉0.1～15g、NaCl濃度為5～30g、蔗糖5～50g、FeCl₃0.01～1g，水定容至1L，pH7～8。

根據本發明優選的，低鹽發酵培養基每升組分如下：

蛋白胨5～30g、酵母浸粉0.1～10g、NaCl濃度為10～20g、蔗糖5～30g、FeCl₃0.01～0.5g，水定容至1L，pH7.5。

根據本發明優選的，所述的水為自來水、去離子水或蒸餾水。