[發明專利]通過麥粒培養基制備純化ZEN毒素的方法

有效

• 申請號: 201310310376.8
• 申請日: 2013-07-23
• 公開（公告）號: CN103351371A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發明（設計）人: 董飛;徐劍宏;祭芳;殷憲超;史建榮
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C07D313/00
• 分類號: C07D313/00
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 孫忠浩

1.一種通過麥粒培養基制備純化ZEN毒素的方法，利用ZEN毒素苯環結構上羥基所具有的酸性，從接種禾谷鐮刀菌的麥粒培養基中提取含有ZEN毒素的粗提液，其特征在于：將含有ZEN毒素的粗提液加入過量的氫氧化鈉堿化，使ZEN毒素溶解于水中，與有機溶劑分離；通過酸化調節含有ZEN毒素的水相至pH2.0~7.0，恢復結構，加入有機試劑使ZEN毒素重新溶解于有機試劑中，與水相分離，濃縮有機試劑得到ZEN粗毒素；采用制備型液相色譜對ZEN毒素在液相色譜上的紫外吸收峰進行回收，獲得制備的ZEN毒素，具體的步驟是：

a)?將禾谷鐮刀菌活化后接到綠豆湯液體培養基中，28℃搖床振蕩培養5天后用滅菌紗布過濾得到禾谷鐮刀菌孢子液，孢子液濃度為1×10⁷?個/ml?，取2ml孢子液接到200g麥粒培養基中，28℃光培養25天，獲得含有ZEN毒素的培養物；

b)?稱取100g含有ZEN毒素的培養物，加入500ml體積比80:20的乙腈/水提取液，搖床室溫振蕩30分鐘，離心后收集含有ZEN毒素的粗提液；

c)?將含有ZEN毒素的粗提液旋轉蒸干后加入20ml色譜純甲醇重新溶解，取2ml用于粗提液的檢測，重新蒸干剩余粗提液后加入50ml體積比1:1的三氯甲烷/水溶液重新溶解，加入過量的氫氧化鈉固體，直到氫氧化鈉不能溶解為止，混勻分層后取上層提取物；

d)?將c步驟上層提取物裝入試管，然后加入鹽酸酸化，調節至pH2.0~7.0后加入等體積的三氯甲烷，混勻分層后取下層，旋轉蒸干下層后重新溶解在色譜純的甲醇中，采用高效液相色譜檢測pH2.0~7.0條件下ZEN毒素含量；高效液相色譜檢測條件為：流速V=0.6ml/min，紫外吸收波長λ=236nm，流動相中甲醇與水的體積比為80:20，利用制備型液相色譜的餾分收集器收集在8.00-8.70?min之間含有ZEN毒素的流動相，獲得純化的ZEN毒素；

所述的綠豆湯培養基為：準確稱取綠豆3g，加入100ml單蒸水，電磁爐加熱至綠豆表皮開始破裂，紗布過濾后定容至100ml，裝入250ml三角瓶，121℃滅菌30分鐘；所述的麥粒培養基為：將麥粒經單蒸水浸泡過夜后，去除單蒸水將濕麥粒裝入滅菌袋中，121℃滅菌30分鐘。

2.根據權利要求?1所述的通過麥粒培養基制備純化ZEN毒素的方法，其特征在于：最佳方案是：d步驟是將3ml的c步驟上層提取物裝入試管，加入鹽酸酸化，調節至pH6.0后每管加入3ml三氯甲烷，混勻分層后取下層，旋轉蒸干下層后重新溶解在2ml色譜純的甲醇中，采用高效液相色譜檢測pH6.0條件下ZEN毒素含量；高效液相色譜檢測條件為：流速V=0.6ml/min，紫外吸收波長λ=236nm，流動相中甲醇與水的體積比80:20；利用制備型液相色譜的餾分收集器收集在8.00-8.70?min之間含有ZEN毒素的流動相，獲得純化的ZEN毒素，10g培養物可以制備0.2μg?ZEN毒素。

3.根據權利要求?1或2所述的通過麥粒培養基制備純化ZEN毒素的方法，其特征在于：a)步驟使用的禾谷鐮刀菌為禾谷鐮刀菌GZ3639。

4.根據權利要求?3所述的通過麥粒培養基制備純化ZEN毒素的方法，其特征在于：采用高效液相色譜—質譜聯用技術對純化的ZEN毒素進行鑒定，結果表明，ZEN毒素的純度在98%以上。