[發明專利]一種提高禽流感抗原利用率的方法

有效

• 申請號: 201310310020.4
• 申請日: 2013-07-23
• 公開（公告）號: CN103357004A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 李晶梅;靖志強;漆世華;溫文生;秦紅剛;朱薇;李偉;張萍;薛霜;于義娟;謝紅玲
• 申請（專利權）人: 武漢中博生物股份有限公司
• 主分類號: A61K39/145
• 分類號: A61K39/145;A61P31/16
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

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技術領域

本發明涉及動物疫苗制備工藝，具體涉及一種提高禽流感抗原利用率的方法。

背景技術

禽流感（Avian?Influenza，AI）是由A型流感病毒引起的一種禽類傳染病。防控禽流感最有效的方法是應用禽流感疫苗。目前，禽流感疫苗的種類主要有全病毒滅活疫苗和基因工程疫苗。禽流感全病毒滅活疫苗包括雞胚為原料的全病毒滅活疫苗和細胞為原料的全病毒滅活疫苗；禽流感基因工程疫苗包含重組亞單位疫苗、病毒活載體疫苗、核酸疫苗、病毒樣顆粒疫苗等。

傳代細胞培養禽流感病毒制備禽流感抗原的機理如下：禽流感病毒感染細胞以出芽方式繁殖子代病毒；HA，NA和M2蛋白在細胞內沿著高爾基體移動，定位到胞漿膜上，然后與基質蛋白、病毒的核衣殼、RNP（核糖核蛋白）一起組裝形成子代病毒粒子；病毒釋放部位的胞漿膜形成了子代病毒粒子的囊膜，將基質蛋白和核衣殼包裹起來，病毒粒子最后以出芽方式從細胞膜上釋出；病毒粒子分泌到培養液中，培養液即為禽流感抗原。昆蟲桿狀病毒表達系統制備禽流感抗原，與禽流感病毒繁殖情況類似，昆蟲桿狀病毒表達系統表達的禽流感病毒樣顆粒也是以出芽方式分泌到培養液中。以如上兩種方法獲得禽流感抗原的同時，用于培養禽流感病毒的細胞和昆蟲細胞的表面仍嵌有大量保護性蛋白尚未以出芽方式釋放到培養液中，生產上廢棄這些細胞也就廢棄了這部分抗原物質。簡單的凍融方法僅能釋放胞內抗原，仍無法獲得、利用包膜上的大量抗原。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種提高禽流感抗原利用率的方法，該方法可操作性強，能夠提高抗原利用率。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種提高禽流感抗原利用率的方法，包括如下步驟：收集通過傳代細胞培養禽流感病毒制備禽流感抗原或昆蟲桿狀病毒表達系統制備禽流感抗原所剩余的細胞；破碎收集的細胞，使細胞膜碎裂成類似禽流感病毒大小的細胞碎片，離心棄去未碎裂或碎裂不完全的細胞沉淀，獲得表面嵌有禽流感免疫原性蛋白的類似禽流感病毒大小的細胞碎片，以此細胞碎片作為抗原制備疫苗或將此細胞碎片與禽流感抗原混合制備疫苗。

所述的傳代細胞培養禽流感病毒制備禽流感抗原的方法優選為：棄去貼壁培養、載體懸浮培養或純懸浮培養的傳代細胞（Vero細胞、MDCK細胞）的細胞培養液，加入病毒培養液（病毒培養液更適宜病毒生長，實質上仍是細胞培養液），接種禽流感病毒，進行培養，收獲培養液。

所述的昆蟲桿狀病毒表達系統制備禽流感抗原的方法優選為：往懸浮培養的昆蟲細胞（Sf9、Sf21、High?Five）中接種重組桿狀病毒，進行培養，收獲培養液；所述的重組桿狀病毒能表達禽流感病毒樣顆粒。

所述的收集優選為通過離心收集。

所述的破碎的方法優選為機械破碎、物理破碎或化學與生物化學破碎；機械破碎優選高速剪切；物理破碎優選高壓沖擊或超聲；化學與生物化學破碎的裂解液優選為允許在疫苗中使用的表面活性劑；所述的破碎優選為先用鹽離子緩沖液重懸收集的細胞再進行破碎；鹽離子緩沖液的體積優選為原培養體積的0.1～1倍。

傳代細胞培養全病毒制備禽流感抗原和昆蟲桿狀病毒表達系統制備禽流感抗原時，收獲的抗原是細胞培養液，細胞做為廢棄物處理。但是在細胞膜上有禽流感病毒的表面蛋白，同時也是保護性蛋白。本發明將細胞進行破碎，收獲類似禽流感病毒的大小的細胞碎片。類似禽流感病毒的大小的細胞碎片是適宜免疫系統識別的，其上的保護性蛋白可以刺激機體產生針對禽流感保護性蛋白的免疫反應。以細胞碎片制備疫苗或在上清抗原中添加細胞碎片制備疫苗，可以達到防控禽流感的目的。

本發明的有益效果在于：本發明利用了禽流感抗原常規生產（傳代細胞培養禽流感病毒制備禽流感抗原和昆蟲桿狀病毒表達系統制備禽流感抗原）中廢棄的細胞制備抗原，提高抗原的利用率，與單獨使用常規生產中的上清做抗原相比產量得到了提高，是經濟的禽流感抗原制備方法。

附圖說明

圖1是本發明提高禽流感抗原利用率的方法的操作流程圖。

具體實施方式

下面結合實施例及附圖對本發明做進一步詳細的描述，但不應理解為對本發明的限制。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。

本發明提高禽流感病毒抗原利用率的方法的操作流程圖如圖1所示。

實施例1??利用副產物細胞（感染禽流感的MDCK細胞）制備禽流感抗原

（1）背景?