[發(fā)明專利]一種利用枯草芽孢桿菌表達(dá)外源蛋白的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310308517.2
• 申請(qǐng)日: 2013-07-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103421834A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪以真;欒超
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/75
• 分類號(hào): C12N15/75;C07K19/00;C07K1/22;C07K1/18
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及一種利用枯草芽孢桿菌表達(dá)外源蛋白的方法。?

背景技術(shù)

隨著全球范圍內(nèi)耐藥性細(xì)菌的不斷發(fā)現(xiàn)，而全新化學(xué)結(jié)構(gòu)新藥的研發(fā)速度遠(yuǎn)低于耐藥菌的進(jìn)化速度，加上化學(xué)藥物的開(kāi)發(fā)難度和投入費(fèi)用逐漸增加，抗菌肽以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)成為近年來(lái)藥物開(kāi)發(fā)的研究熱點(diǎn)。通過(guò)化學(xué)合成的方法獲得抗菌肽成本較高；直接從生物體中分離純化則相對(duì)復(fù)雜。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，利用基因工程和發(fā)酵工程技術(shù)生產(chǎn)藥物蛋白或多肽成為一種經(jīng)濟(jì)高效的生產(chǎn)方式。?

目前，已有眾多抗菌肽在異源宿主中表達(dá)，其中大多數(shù)的抗菌肽在大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。但大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)易形成包涵體、細(xì)胞壁含有致病性內(nèi)毒素等；酵母表達(dá)系統(tǒng)后期大規(guī)模發(fā)酵通常需要較復(fù)雜的培養(yǎng)基，因此生產(chǎn)成本較高?？莶菅挎邨U菌是一種被公認(rèn)安全（Generally?Recognized?As?Safe,GRAS）微生物。它能將重組蛋白分泌至胞外，不易形成包涵體，細(xì)胞壁無(wú)內(nèi)毒素，且后期發(fā)酵成本遠(yuǎn)低于酵母表達(dá)系統(tǒng)。但目前在枯草芽孢桿菌中重組表達(dá)抗菌肽的報(bào)道較少。由于抗菌肽對(duì)宿主菌具有毒性，因此多采用融合表達(dá)策略。這不僅需要表達(dá)融合蛋白，同時(shí)還需要切割融合蛋白釋放抗菌肽的蛋白酶。蛋白酶如SUMO?protease?1等已在大腸桿菌中成功表達(dá)并商業(yè)化。但在枯草芽孢桿菌中，尚無(wú)純化得到具有活性的切割融合蛋白所需的蛋白酶的報(bào)道，這極大地限制了抗菌肽在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的進(jìn)展。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種利用枯草芽孢桿菌表達(dá)外源蛋白的方法。?

一種利用枯草芽孢桿菌表達(dá)外源蛋白的方法，所述方法包括以下步驟：?

1）將外源蛋白基因插入枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)載體得到外源蛋白枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)載體；

2）外源蛋白枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)載體在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)，分泌外源蛋白；

3）將步驟2)分泌的外源蛋白經(jīng)親和層析純化外源蛋白。

所述的外源蛋白基因?yàn)镾UMO-CBF基因。?

所述的SUMO-CBF基因序列為如SEQ?ID?NO:1所示。?

所述的融合蛋白基因?yàn)镾UMO?protease?1基因。?

所述的融合蛋白基因?yàn)镾UMO?protease?1基因，所述的步驟2)分泌的外源蛋白先經(jīng)陽(yáng)離子交換，然后經(jīng)親和層析純化。?

所述的SUMO?protease?1優(yōu)化后的基因序列如SEQ?ID?NO:2所示。?

一種利用枯草芽孢桿菌表達(dá)重組抗菌肽CBF外源蛋白的方法，所述方法包括以下步驟：?

a）用所述的純化SUMO?protease?1切割所述的純化SUMO-CBF，釋放重組抗菌肽CBF；

b）用親和層析和陽(yáng)離子交換純化a)所得到的重組抗菌肽CBF。

本發(fā)明的有益效果：1、首次在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中純化得到具有活性的SUMO?protease?1，為使用SUMO技術(shù)在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中重組表達(dá)陽(yáng)離子抗菌肽提供了可能。2、使用本發(fā)明在重組表達(dá)抗菌肽時(shí)，融合蛋白不易形成包涵體，直接分泌至胞外，并且重組陽(yáng)離子抗菌肽不含內(nèi)毒素，省去了大量下游的純化工作。3、尤其是利用同一個(gè)系統(tǒng)純化外源蛋白，相輔相成，減少了外來(lái)污染物或者不純物質(zhì)的引入。如果運(yùn)用多種表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)外源蛋白，會(huì)對(duì)下游純化工作帶來(lái)極大的壓力，降低大規(guī)模應(yīng)用的前景。?

附圖說(shuō)明

圖1?是Western?blot分析2~18?h枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)分泌上清中SUMO-CBF表達(dá)水平圖。泳道1~9，2~18?h分泌上清中的SUMO-CBF。?

圖2是?純化前后外源蛋白SUMO-CBF的SDS-PAGE電泳圖。泳道1，蛋白marker；泳道2，陰性對(duì)照（pHT43）表達(dá)上清；泳道3，誘導(dǎo)表達(dá)上清；泳道4，親和層析后的SUMO-CBF；泳道5，親和層析和陰離子交換后的SUMO-CBF。?

圖3是?Western?blot分析2~16h枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)分泌上清中SUMO?protease?1活性圖。泳道1，空白對(duì)照；泳道2~9，2~16h上清中SUMO?protease?1活性。?

圖4是?純化前后SUMO?protease?1的SDS-PAGE電泳圖。泳道1，蛋白marker；泳道2，陰性對(duì)照（pHT43）表達(dá)上清；泳道3，誘導(dǎo)表達(dá)上清；泳道4，陽(yáng)離子交換后的SUMO?protease?1；泳道5，陽(yáng)離子交換和親和層析后的SUMO?protease?1。?