[發(fā)明專利]來源于超嗜熱古菌的酰胺酶及其編碼基因與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310308510.0
• 申請日: 2013-07-22
• 公開（公告）號: CN103382464A
• 公開（公告）日: 2013-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐俊;付玲;肖湘
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N9/80
• 分類號: C12N9/80;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12N1/20;C12P7/54;C12P7/40;C12P13/14;C12P13/20;C12R1/01
• 代理公司: 上海漢聲知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31236
• 代理人: 牛山;陳少凌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種酰胺酶及其編碼基因與應(yīng)用，具體涉及一種來源于超嗜熱古菌的酰胺酶及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)

腈類化合物是一類含腈基功能團的化學物質(zhì)(R-CN)，是一種重要的化工和化纖工業(yè)合成原料。傳統(tǒng)的化學水解方法需要在較為苛刻的條件（強酸、強堿）下完成，并且會伴隨大量雜質(zhì)產(chǎn)生，給后續(xù)的分離純化帶來困難，增加了成本。而酶法水解具有高效性、高選擇性、環(huán)境污染小、成本低等優(yōu)點，有著傳統(tǒng)的化學水解方法無可比擬的優(yōu)越性。腈類化合物酶促水解有兩條途徑：一是通過腈水解酶(nitrilase,EC3.5.5.1)使用兩個水分子將腈化物直接轉(zhuǎn)化成羧酸；二是先通過腈水合酶(nitrile?hydratase,EC4.2.1.84,NHase)使用一分子的水將腈化物轉(zhuǎn)化成酰胺,再通過酰胺酶(amidase，EC3.5.1.4)將酰胺轉(zhuǎn)化成羧酸，并釋放出氨氣。由腈化合物出發(fā)可以獲得酰胺、羧酸、酯、羰基以及雜環(huán)化等價值更高、應(yīng)用范圍更廣的一類化合物，它們被廣泛的應(yīng)用于化工原料、醫(yī)藥中間體、維生素的前體。因此，多年以來一直受國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。其中酰胺酶（EC3.5.1.4）是腈化合物轉(zhuǎn)化酶家族的重要成員，能催化酰胺生成羧酸并釋放氨氣。

酰胺酶根據(jù)氨基酸序列特征又可以分成屬于腈水解酶家族（nitrilase?superfamily）的酰胺酶和指紋特征性酰胺酶（amidase?signature?family(AS酰胺酶)）。AS家族酰胺酶都具有一段大約130個氨基酸組成的指紋序列，同時還具有一段高度保守的motif：GGSS。這類酶一般都具有較廣的底物作用范圍并表現(xiàn)出立體選擇性。R.rhodochrousJ1、Rhodococcus?sp.R312、Sulfolobus?solfataricus、Geobacillus?pallidus?RAPc8等菌株中酰胺酶均屬于AS家族。腈水解酶家族酰胺酶是由活性中心為Glu-Cys-Lys構(gòu)成的同源二聚體、四聚體或者六聚體。腈水解酶家族可以被劃分為13個分支，其中已經(jīng)可以預(yù)知底物特異性的分支有9個，盡管這9個分支的酶在結(jié)構(gòu)上都與腈水解酶相似，但是只有第1支具有腈水解酶活力，其余8支則分別具有酰胺酶活力或者氨基轉(zhuǎn)移酶活力。Nesterenkonia、Thermococcus、Pyrococcus等菌株中含有這類家族的酰胺酶成員。

在生物體內(nèi)，酰胺酶參與細胞內(nèi)氮的代謝，維持生命活動；在體外，這些產(chǎn)物廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥和化工產(chǎn)品等領(lǐng)域。此外，酰胺酶的立體選擇性使得該酶在制備手性中間體以及光學純的氨基酸中具有巨大的潛力而備受工業(yè)界的重視。由于多數(shù)情況下，酰胺酶催化不同的底物進行手性拆分反應(yīng)時的立體選擇性相差很大，隨著目前對醫(yī)藥、化工產(chǎn)品的高效開發(fā)，對高光學純手性化合物的需求越來越大，這就對酰胺酶的立體選擇性提出了更高的要求。

目前酰胺酶在工業(yè)上大規(guī)模應(yīng)用的例子還不多，Colby等人利用固定化和細胞包埋技術(shù)對Rhodococcus?AJ270轉(zhuǎn)化丙烯酞胺生產(chǎn)丙烯酸過程及反應(yīng)器放大方面進行了研究，實現(xiàn)了較高的丙烯酸產(chǎn)率(22h內(nèi)大于97%)；瑞士Lonza公司已實現(xiàn)了利用微生物手性拆分生產(chǎn)S-哌嗪-2-甲酸，（R）-3,3,3-三氟-2-羥基-2-甲基丙酸。

酰胺酶酶源豐富，目前國內(nèi)外學者已經(jīng)從Bacillus、Arthrobacter、Rhodococcus、Geobacillus、Pseudomnas、Ochrobactrum、Methylophilus、超嗜熱古菌Sulfolobus?solfataricus以及工程菌Rhodococcus?sp.R312等菌株中分離純化出酰胺酶，并對其生化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)以及催化反應(yīng)機理做了詳細的研究。盡管如此，關(guān)于超嗜熱古菌中酰胺酶的研究則相對較少，而針對超嗜熱古菌來源的腈水解酶超家族中的酰胺酶的分離純化則未見報道。因此，有必要研究開發(fā)出一種來源于超嗜熱古菌的酰胺酶。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種來源于超嗜熱古菌的酰胺酶及其編碼基因與應(yīng)用，該酰胺酶屬于腈水解酶超家族，能有效的將脂肪族酰胺底物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的脂肪酸，催化效率高，而且該酰胺酶為超嗜熱酶，適合用于需要較高反應(yīng)溫度的工業(yè)生產(chǎn)中。

本發(fā)明的第一個目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：一種如下（a）或（b）的蛋白質(zhì)：

（a）由如SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

（b）SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有酰胺酶活性的由（a）衍生的蛋白質(zhì)。