[發(fā)明專利]一種抑制PUMA功能改善iPS細胞建立功效的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310306002.9
• 申請日: 2013-07-19
• 公開（公告）號: CN103571794A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 程濤;李彥欣
• 申請（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院（血液學研究所）
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867
• 代理公司: 天津濱海科緯知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12211
• 代理人: 韓敏

1.一種抑制PUMA功能改善iPS細胞建立功效的方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）PUMA^-/-(PUMA基因敲除)或PUMA^-/+小鼠胚胎成纖維細胞MEF的制備、傳代、凍存；

（2）DH5α大腸桿菌株轉(zhuǎn)化質(zhì)粒PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF4，并進行質(zhì)粒小提和質(zhì)粒大提；

（3）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝、滴度測定與凍存：將攜帶有PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44個轉(zhuǎn)錄因子的質(zhì)粒引入包裝細胞Plat-E細胞中，回收在培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并進行滴度測定與凍存；

（4）PUMA^-/-或PUMA^-/+小鼠胚胎成纖維細胞MEF的重編程

將步驟（3）中的攜帶有PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44個轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染步驟（1）得到的PUMA^-/-或PUMA^-/+小鼠胚胎成纖維細胞MEF，并用飼養(yǎng)層細胞支持培養(yǎng)感染的PUMA^-/-或PUMA^-/+小鼠胚胎成纖維細胞MEF，連續(xù)培養(yǎng)，出現(xiàn)的克隆為PUMA^-/-或PUMA^-/+小鼠iPS細胞；

（5）敲降PUMA功能的人成纖維細胞的重編程

將人PUMA?shRNA（載體Plk0.1）和攜帶有人PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44個轉(zhuǎn)錄因子的質(zhì)粒引入包裝細胞Plat-E中，回收在培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的病毒載體，并將回收的病毒載體感染人成纖維細胞，并用飼養(yǎng)層細胞支持培養(yǎng)感染的人成纖維細胞，培養(yǎng)7天后，用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)，出現(xiàn)的克隆為敲降PUMA功能的人iPS細胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制PUMA功能改善iPS細胞建立功效的方法，其特征在于：所述步驟（1）中的具體步驟為：取8-10周的PUMA^-/-或PUMA^-/+小鼠，按2：1的雌雄比例合籠，處死孕期為13.5天的孕鼠，將小鼠胚胎從子宮中剝離，去除頭和內(nèi)臟組織，將單個胚胎的軀干，剪碎至糊狀，胰酶消化，F(xiàn)M重懸，培養(yǎng)24-48h后，將MEF細胞按常規(guī)方法進行傳代，2×FM凍存液凍存P0代、P1或P2代細胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項所述的抑制PUMA功能改善iPS細胞建立功效的方法，其特征在于：所述步驟（3）的具體步驟為：每100mm皿接種8x10⁶-1x10⁷個Plat-E細胞，融合度達到90%時，將培養(yǎng)皿中的細胞培養(yǎng)液換成5ml新鮮DMEM+10%FBS，制備質(zhì)粒和lipofectamine2000混合液，10μl?lipofectamine2000與500μl?OPTI-MEM混合，室溫放置5min，攜帶有PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44個轉(zhuǎn)錄因子的質(zhì)粒各10μg與500μl?OPTI-MEM混合，室溫放置5min，將上述兩種液體輕輕混合，室溫靜置20min，將混合液逐滴加入100mm皿中，1ml/皿，混勻，培養(yǎng)6-8h后換新鮮的DMEM+10%FBS分別在培養(yǎng)后48h和72h收集逆轉(zhuǎn)錄病毒上清并濃縮，收集的部分逆轉(zhuǎn)錄病毒進行滴度測定。