[發明專利]一種利用核苷酸衍生物調節限制性核酸內切酶的酶切活性的方法

有效

• 申請號: 201310305768.5
• 申請日: 2013-07-19
• 公開（公告）號: CN103436531A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 關一夫;趙國杰
• 申請（專利權）人: 關一夫;趙國杰
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 李宇彤

技術領域

本發明涉及分析化學、生物化學與分子生物學的技術領域，提供了一種對限制性核酸內切酶的酶切活性進行調節的方法。該方法可以應用于包括合成生物學、分子克隆、生物檢測等各種生物化學與分子生物學的技術中。

背景技術

1、核苷酸衍生物

核苷酸衍生物是在天然核苷酸的化學結構上經過化學修飾而得到的一類核苷酸類似物。根據修飾部位的不同，可以將其分為堿基修飾的核苷酸衍生物、戊糖修飾的核苷酸衍生物，以及磷酸修飾的核苷酸衍生物。這些核苷酸衍生物表現出各種不同的物理化學以及生物特性。有的核苷酸衍生物與DNA有較強的親和力，而有些則傾向于與RNA結合。有些核苷酸衍生物可以提高對雜交雙鏈中的錯配堿基對的識別能力，增加寡核苷酸探針的檢測特異性。有些核苷酸衍生物對核酸酶有較強的抵抗能力，能增強反義核酸藥物在生理條件下的穩定性，提高治療效果。有些核苷酸衍生物可以用來調控核酸鏈的空間構象。因此，核苷酸衍生物已經廣泛地應用在涉及各種生物分子相互作用的基礎研究中以及以核酸為基礎的臨床治療和轉化醫學中。

2、限制性核酸內切酶以及應用

限制性核酸內切酶（Restriction?endonuclease，RE）是一類特殊的蛋白質分子，它們可以識別特定的DNA序列,并在識別序列上將雙鏈DNA切割成為兩個片段。限制性核酸內切酶可以分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。在基因工程技術中最常用的是Ⅱ型。Ⅱ類限制性核酸內切酶所能夠識別的核苷酸序列都具有回文結構（palindrome），酶切后形成的產物具有粘性末端或平頭末端的特點。限制性核酸內切酶被廣泛地應用在分子克隆等技術。使用限制性核酸內切酶對DNA片段以及質粒進行酶切，形成粘性末端，再通過連接酶的連接反應，形成重組質粒，進行質粒的復制和蛋白的表達。合成生物學中需要許多限制性核酸內切酶，來完成基因的拼接和構建工作。限制性核酸內切酶還用于臨床疾病的檢測方面，如利用限制性酶切片段長度多態性的分析來確定基因的突變情況。

3、限制性核酸內切酶酶切活性的檢測

檢測限制性核酸內切酶的酶切活性的方法有：表面等離子體共振譜（surface?plasma?resonance?spectroscopy）、電泳遷移率（electrophoresis?mobility?shift?assay，EMSA）、聚合酶鏈反應阻滯實驗（PCR-stop?experiment）、熒光共振能量轉移（flourescence?resonance?energy?transfer，FRET）等。與其他技術相比，FRET具有樣品用量少，檢測周期短，可以進行實時檢測等優點。

利用FRET技術檢測限制性核酸內切酶的酶切活性的基本原理如圖1所示。限制性核酸內切酶的底物是由三條寡核苷酸鏈組成的。它們分別是在5'-末端標記了熒光基團的熒光鏈（F-ON鏈）、在3'-末端標記了熒光淬滅基團的淬滅鏈（Q-ON鏈）以及模板鏈（T-ON鏈）。熒光鏈和淬滅鏈可以與模板鏈通過互補雜交原理，形成DNA雙鏈復合物。在模板鏈和熒光鏈上，分別含有限制性核酸內切酶所能識別的核苷酸序列。因此，DNA雙鏈復合物就成為了限制性核酸內切酶的底物。在DNA雙鏈復合物上，熒光鏈的熒光發射基團和淬滅鏈的熒光淬滅基團相互接近，使得熒光被淬滅基團淬滅掉。當加入限制性核酸內切酶后，底物DNA雙鏈被酶切成為兩個片段，含有熒光基團的寡核苷酸鏈過于短小，不能繼續與模板鏈形成穩定的互補雙鏈，從復合物上脫落下來，遠離了熒光淬滅基團，發射出熒光。利用該原理，在加入限制性核酸內切酶后，通過檢測熒光強度的變化，可以方便地和實時地監測內切酶催化的酶切反應的全過程。

發明內容

本發明的目的是提供一種可以調節限制性核酸酶酶切活性的方法。其包含以下部分：核苷酸衍生物對限制性核酸內切酶底物上的酶切位點的修飾、限制性核酸內切酶催化的酶切反應體系。

本發明中，所述的核苷酸衍生物是指在天然核苷酸的戊糖或脫氧戊糖上經過化學修飾形成的核苷酸衍生物，包括在O2'-原子上經過化學修飾形成的單環戊糖結構、在C2'-原子上經過化學修飾形成的鹵代單環戊糖結構、在O2'-和C4'-原子之間經過化學修飾形成的雙環戊糖結構、在O2'-和C1'-原子之間經過化學修飾形成的雙環戊糖結構。由于水分子的水化作用、化學修飾基團的電負性、化學修飾基團的空間阻礙性等元素，這些核苷酸衍生物戊糖環的柔韌度受到了限制，一般表現出C3'-內趨的戊糖環構象（C3'-endo?sugar?pucker?conformation）。這種戊糖環構象又將連接堿基的糖苷鍵限定在反式構象（anti?glycosidic?conformation）。