[發(fā)明專利]一種甜瓜種子純度檢驗的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310305714.9
• 申請日: 2013-07-19
• 公開（公告）號: CN103627786A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周賢達(dá);王兆賢;陳會中;王浩波;吳義兵;周桂林;林茂;朱先飛;徐麗媛;王麗梅
• 申請（專利權(quán)）人: 合肥豐樂種業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 合肥和瑞知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 34118
• 代理人: 王挺

1.一種甜瓜種子純度檢驗的方法，按下述步驟操作：

1）DNA提取：

a)將甜瓜種子置于營養(yǎng)缽中發(fā)芽出苗，等到幼苗有2-3片真葉時，取2.5-3.5cm²的葉片于小研缽中，加入4×CTAB提取緩沖液將其研碎，轉(zhuǎn)入離心管，65℃水浴半小時；

b)加入與提取緩沖液等體積的的苯酚-氯仿-異戊醇混合液，12000rpm離心10分鐘，吸其上清置于另一離心管，加入冰凍無水乙醇，-20℃冰柜內(nèi)放置60分鐘沉淀DNA；

c)12000rpm離心10分鐘，棄上清；加濃度為75%的乙醇，靜置4分鐘去鹽，棄去乙醇；

d)離心管置于加熱通風(fēng)烘箱中，65℃風(fēng)干；

e)加滅菌雙蒸水溶解待用；

上述4×CTAB提取緩沖液由4%(w/v)的十六烷基三甲基溴化銨,1.4mol/L的氯化鈉NaCl，0.1mol/L的Tris-Cl緩沖液（pH8.0），0.02mol/L的乙二胺四乙酸和0.2%（v/v）的α-巰基乙醇構(gòu)成；

上述苯酚-氯仿-異戊醇混合液由氯仿和異戊醇混合而成，其混合體積比為1：24︰1；

2）PCR反應(yīng)：

在PCR管中分別加入DNA模板、改性緩沖液、三磷酸脫氧核糖核苷、引物FLXGSSRL和FLXGSSRR、Taq酶及雙蒸水；先94℃預(yù)變性4分鐘；再94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，32個循環(huán)；72℃延伸7分鐘，95℃水浴4分鐘變性后置冰上；

上述改性緩沖液為10×PCR緩沖液+2×10^-3mol/L氯化鎂；

上述引物FLXGSSRL序列為5’-GATTCATTAGGCGGTGAG-3’；

上述引物FLXGSSRR序列為5’-CGTGGGTTGATTGATGTTGT-3’；

3）瓊脂糖凝膠電泳檢測：

將瓊脂糖加入100ml的5×TBE中攪拌混合均勻后加熱，配制成濃度為3%的瓊脂糖溶液，室溫下冷卻至55-65℃，每200ml瓊脂糖溶液中加入0.5μg的核酸染料sybe?Green?I，倒入專用瓊脂糖制膠模板內(nèi)，插梳；待瓊脂糖溶液完全凝固后，拆除模板和梳子，將凝膠放入具有1.5×TBE電泳液的電泳槽中，以電泳液高出凝膠0.5cm為宜，點樣；設(shè)定電壓200V，電泳半小時，關(guān)閉電源，使用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照；

4）受檢種子純度計算：

用上述方法分別獲取甜瓜雜交一代和親本種子電泳譜帶，計數(shù)受檢樣品中有清晰的兩條帶型的種子數(shù)，并用下式計算受檢樣品的種子純度（%）=受檢樣品中有清晰的兩條帶型的種子數(shù)/受檢種子總數(shù)×100%。