[發明專利]豬丹毒桿菌的PCR引物及其應用

有效

• 申請號: 201310305524.7
• 申請日: 2013-08-20
• 公開（公告）號: CN103397023A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發明（設計）人: 王雷;周慶豐;宋延華;潘永飛
• 申請（專利權）人: 廣東溫氏食品集團股份有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 廣州市深研專利事務所 44229
• 代理人: 陳雅平

技術領域

本發明屬于動物醫學的分子生物學和生產領域，具體涉及主要用于鑒別豬丹毒弱毒疫苗株G4T10株和野毒流行株（包括強毒流行株GD1201等非豬丹毒弱毒疫苗株G4T10株的其他豬丹毒毒株）的PCR擴增引物及其應用。

背景技術

豬丹毒（Swine?erysipelas,SE）是由豬丹毒桿菌（Erysipelothrix?rhusiopathiae,?ER）引起的一種急性熱性傳染病，其主要特征為高熱、急性敗血癥、皮膚疹塊（亞急性）、慢性疣狀心內膜炎及皮膚壞死與多發性非化膿性關節炎(Wood?R.L.,?Erysipelas,?in:?Leman,?et?al.?(Eds.),?Diseases?of?swine,?Iowa?State?University?Press,?Ames,?Iowa,?1992,pp.?475–486)。從這些癥狀的豬體內分離到的豬丹毒桿菌大多為血清1型（1a亞型和1b亞型）和2型（Takashi?et?al.,?Protection?Effect?of?NaOH-Extracted?Erysipelothrix?rhusiopathiae?J.Vet.Med.Sci.60(1):9-14.1998)。本病曾經被稱為我國“三大傳染病”?之一，近年來，隨著養豬集約化發展豬丹毒逐漸淡出人們的視野，但該病并沒有完全被凈化，在全國各地區一直都有零星出現，給養豬戶造成了嚴重的經濟損失（龔平陽，王連想，陽志香．廣東地區豬場豬丹毒的發病特點及綜合防控措施［Ｊ］．畜禽業總，2010（11）：11－12．）。?

豬丹毒桿菌表面膜蛋白(Surface?protective?antigen?A,?SpaA)基因全長約為1881bp，編碼大小64KD的蛋白。SpaA蛋白是其主要的免疫原性蛋白，并在感染過程中起作用（Takahashi?et?al.,?DNA?relatedness?amongst?Erysipelothrixrhusiopathiae?strains?representing?all?twenty-three?serovars?and?Erisiperothrix?tonsillarum.?Int.J.Syst.Bacteriol.42,?469-473.1992，Sou-ichi?Makino?et?al.,?Surface?antigen,?SpaA,?of?Erysipelothrix?rhusiopathiae?binds?to?Gram-positive?bacterial?cell?surfaces，FEMS?Microbiology?Letters?186?(2000)?313-317）。

目前預防該疾病主要采用豬丹毒桿菌弱毒疫苗來進行免疫防控，我國采用的疫苗主要為豬丹毒弱毒疫苗株G4T10株，該疫苗株是由江蘇省農業科學院和南京生物藥品廠在20世紀70年代聯合研制而成，豬丹毒弱毒株G4T10是強毒株經豚鼠370代和在含有0.01%~0.04%吖啶黃血液瓊脂培養基上傳10代獲得的。

目前，由于生產上常用豬丹毒弱毒疫苗株G4T10株進行對豬丹毒的免疫防控，為了監測疫苗的防疫情況和豬丹毒病情的診斷，迫切需要一種對疫苗弱毒株和野毒流行株感染的鑒別診斷方法。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術中的上述問題，通過豬丹毒弱毒疫苗G4T10株的SpaA基因序列（Genbank登錄號：KF150604）和強毒株Fujishawa、GD1201株（Genbank登錄號：KF177344）等毒株序列對比發現疫苗弱毒株在1369-1488位置缺失119bp，針對序列此特征設計引物建立疫苗弱毒株G4T10株和野毒株鑒別診斷的PCR擴增方法。

本發明提供的豬丹毒桿菌的PCR引物，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1~2所示。

本發明還提供了上述豬丹毒桿菌的PCR引物在制備豬丹毒桿菌的檢測試劑中的應用。

優選地，上述豬丹毒桿菌的PCR引物在制備豬丹毒桿菌的檢測試劑中的應用，所述豬丹毒桿菌為豬丹毒弱毒疫苗株G4T10株和/或豬丹毒野毒流行株。

本發明還提供了一種豬丹毒桿菌的檢測試劑盒，包括如下組分：SEQ?ID?NO:1~2所示的引物序列，DNA聚合酶，PCR緩沖液，dNTP混合物和無菌雙蒸水。?