[發明專利]羅氏沼蝦野田村病毒NASBA-LFD檢測方法及其檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201310305397.0
• 申請日: 2013-07-19
• 公開（公告）號: CN103409556A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 林鋒;沈錦玉;劉莉;錢冬;曹錚;王軍毅;郝貴杰;盛鵬程;袁雪梅;吳穎蕾
• 申請（專利權）人: 浙江省淡水水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

1.一種羅氏沼蝦野田村病毒NASBA-LFD檢測方法，其特征在于：包括如下步驟：

病毒RNA的提取：

（1）取20-30mg羅氏沼蝦幼蝦或成蝦肌肉組織，加入350-500μL裂解液勻漿，離心；

（2）取步驟（1）離心所得上清液，與等體積的70%無水乙醇混合均勻后，將混合液與玻璃纖維素膜結合；

（3）依次用去蛋白液和漂洗液洗滌玻璃纖維素膜；

（4）用RNase?free?water洗脫玻璃纖維素膜上吸附的RNA；

NASBA擴增：

（5）配制預反應液，所述預反應液體積為16-21μL，包括：0.2-0.4μmol/L引物MrNV-P1F，0.2-0.4μmol/L引物MrNV-P1R，?0.1-0.2μmol/L?探針MrNV-FITC-PROBE，30-50mmol/L的?pH8.0-8.5Tris-HCl，?20-50mmol/L?氯化鉀，?10-50?mmol/L?氯化鎂，2-10mmol/L?二硫蘇糖醇，10%-15%?DMSO，1-2mmol/L?dNTP，2-4mmol/L?NTP，0.1-0.2μg/μL?BSA，10-20U?RNase?抑制劑，2-6U逆轉錄酶AMV，20-40U??T7?RNA?聚合酶，0.1-0.3U?RNaseH；

引物MrNV-P1F序列見SEQ?ID?NO：1，引物MrNV-P1R序列見SEQ?ID?NO：2，探針MrNV-FITC-PROBE序列見SEQ?ID?NO：3；

（6）在16-21μL預反應液中加入4-9μL步驟（4）所得?RNA作為模板，控制反應體系總體積為20-25μL，然后在40℃-42℃下反應60-120min；

LFD試紙檢測：

（7）取步驟（6）所得NASBA擴增產物5-10μL滴到LFD試紙的點樣處，然后在點樣處前端滴上50-100μL緩沖液，5-15分鐘后根據試紙條上的顯色帶判定檢測結果。

2.根據權利要求1所述的羅氏沼蝦野田村病毒NASBA-LFD檢測方法，其特征在于：所述裂解液包括濃度為30-60mmol/L?的pH7.3-7.6?Tris-HCL，濃度為3-6mol/L的異硫氰酸胍，以及濃度為5-10mmol/L?EDTA。

3.根據權利要求1所述的羅氏沼蝦野田村病毒NASBA-LFD檢測方法，其特征在于：所述去蛋白液包括濃度為10-50mmol/L的pH7.3-7.6?Tris-HCL，濃度為0.4-0.6mol/L異硫氰酸胍，以及體積濃度為10-30%的無水乙醇。

4.根據權利要求1所述的羅氏沼蝦野田村病毒NASBA-LFD檢測方法，其特征在于：所述漂洗液包括濃度為10-50mmol/L的pH7.3-7.6?Tris-HCL，50-150mmol/L?NaCl，以及體積濃度75%的無水乙醇。

5.根據權利要求1或2或3或4所述的羅氏沼蝦野田村病毒NASBA-LFD檢測方法，其特征在于：引物MrNV-P1F為5’端生物素標記引物；探針MrNV-FTIC-PROBE為5’端FITC標記探針。

6.一種羅氏沼蝦野田村病毒NASBA-LFD檢測試劑盒，其特征在于：包括NASBA擴增反應液，16-21μL的NASBA擴增反應液包括：?0.2-0.4μmol/L引物MrNV-P1F，0.2-0.4μmol/L引物MrNV-P1R，?0.1-0.2μmol/L?探針MrNV-FITC-PROBE，30-50mmol/L的?pH8.0-8.5Tris-HCl，?20-50mmol/L?氯化鉀，?10-50?mmol/L?氯化鎂，2-10mmol/L?二硫蘇糖醇，10%-15%?DMSO，1-2mmol/L?dNTP，2-4mmol/L?NTP，0.1-0.2μg/μL?BSA，10-20U?RNase?抑制劑，2-6U逆轉錄酶AMV，20-40U??T7?RNA?聚合酶，0.1-0.3U?RNaseH；

引物MrNV-P1F序列見SEQ?ID?NO：1，引物MrNV-P1R序列見SEQ?ID?NO：2，探針MrNV-FITC-PROBE序列見SEQ?ID?NO：3。