[發(fā)明專利]羅氏沼蝦野田村病毒RT-LAMP-LFD檢測方法及其檢測試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310305396.6
• 申請日: 2013-07-19
• 公開（公告）號: CN103409555A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 林鋒;沈錦玉;劉莉;曹錚;郝貴杰;盛鵬程;吳穎蕾
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省淡水水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務(wù)所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

1.一種羅氏沼蝦野田村病毒RT-LAMP-LFD檢測方法，其特征在于：包括如下步驟：

病毒RNA的提取：

（1）取20-30mg羅氏沼蝦幼蝦或成蝦肌肉組織，加入350-500μL裂解液勻漿，離心；

（2）取步驟（1）離心所得上清液，與等體積的70%無水乙醇混合均勻后，將混合液與玻璃纖維素膜結(jié)合；

（3）依次用去蛋白液和漂洗液洗滌玻璃纖維素膜；

（4）用RNase?free?water洗脫玻璃纖維素膜上吸附的RNA；

RT-?LAMP擴增反應(yīng)：

（5）配制預(yù)反應(yīng)液，所述預(yù)反應(yīng)液體積為16-21μL，包括：1.4-2.0mmol/L?引物MrNV-FIP，1.4-2.0mmol/L引物MrNV-BIP，0.2mmol/L?引物MrNV-F3，0.2mmol/L引物MrNV-B3，0.05-0.15μmol/L?探針MrNV-FITC-PROBE，10-30mmol/L?pH8.0-9.0的Tris-HCl，10-20mmol/L?氯化鉀，10-20?mmol/L?硫酸銨，5-10mmol/L?硫酸鎂，0.1-0.3%?Triton?X-100，0.4-0.8mol/L?甜菜堿，1.4-1.6mmol/L?dNTP，1-2U逆轉(zhuǎn)錄酶AMV，6-10U?Bst?DNA?聚合酶大片段；

引物MrNV-FIP序列見SEQ?ID?NO：1，引物MrNV-BIP序列見SEQ?ID?NO：2，引物MrNV-F3序列見SEQ?ID?NO：3，引物MrNV-B3序列見SEQ?ID?NO：4，探針MrNV-FITC-PROBE序列見SEQ?ID?NO：5；

（6）在16-21μL預(yù)反應(yīng)液中加入4-9μL步驟（4）所得?RNA作為模板，控制反應(yīng)體系總體積為20-25μL，然后在60℃-65℃下反應(yīng)15-60min；

LFD試紙檢測：

（7）取步驟（6）所得RT-?LAMP擴增反應(yīng)產(chǎn)物5-10μL滴到LFD試紙的點樣處，然后在點樣處前端滴上50-100μL緩沖液，5-15分鐘后根據(jù)試紙條上的顯色帶判定檢測結(jié)果。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅氏沼蝦野田村病毒RT-LAMP-LFD檢測方法，其特征在于：所述裂解液包括濃度為30-60mmol/L?的pH7.3-7.6?Tris-HCL，濃度為3-6mol/L的異硫氰酸胍，以及濃度為5-10mmol/L?EDTA。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅氏沼蝦野田村病毒RT-LAMP-LFD檢測方法，其特征在于：所述去蛋白液包括濃度為10-50mmol/L的pH7.3-7.6?Tris-HCL，濃度為0.4-0.6mol/L異硫氰酸胍，以及體積濃度為10-30%的無水乙醇。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅氏沼蝦野田村病毒RT-LAMP-LFD檢測方法，其特征在于：所述漂洗液包括濃度為10-50mmol/L的pH7.3-7.6?Tris-HCL，50-150mmol/L?NaCl，以及體積濃度75%的無水乙醇。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的羅氏沼蝦野田村病毒RT-LAMP-LFD檢測方法，其特征在于：引物MrNV-FIP為5’端生物素標(biāo)記引物；探針MrNV-FTIC-PROBE為5’端FITC標(biāo)記探針。