[發明專利]一種快速提取瓜類基因組DNA的方法

無效

• 申請號: 201310304147.5
• 申請日: 2013-07-19
• 公開（公告）號: CN103409409A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 周賢達;王兆賢;陳會中;吳義兵;周桂林;林茂;朱先飛;徐麗媛;王麗梅;程國旺
• 申請（專利權）人: 合肥豐樂種業股份有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 合肥和瑞知識產權代理事務所(普通合伙) 34118
• 代理人: 王挺

技術領域

本發明涉及瓜類植物組織基因組DNA的提取方法，屬DNA提取技術領域。

背景技術

植物組織基因組DNA的提取是實驗室操作中經常性涉及的基礎操作，特別是從事于植物相關的分子生物學研究中經常需要提取相關植物組織基因組DNA進行后續實驗。傳統植物組織基因組DNA的提取一般使用CTAB法或SDS法，這種操作方法步驟繁瑣、操作難度大、速度緩慢，無法滿足實驗室對大規模植物組織基因組DNA提取的需要。近年來開發的基因組DNA堿煮法來源于細菌質粒DNA小量制備，其為了滿足質粒DNA的提取需求，對細菌細胞膜進行破碎，在pH值高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈不會完全分離，當以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液調節其pH值至中性時，保存在溶液中，而染色體DNA不能復性而纏連的網狀結構，通過離心使兩者分離。堿煮法相比傳統提取方法速度更快、組織需求小、適合大規模操作，從而越來越引起相關科研工作者的重視。

瓜類植物由于其葉片中包含大量多酚類物質，在提取過程中易與空氣中的氧發生氧化，從而影響DNA提取的質量，同時多酚類物質會與PCR反應中的Taq酶結合，影響酶促反應效率，從而降低PCR反應成功率。傳統瓜類植物基因組DNA的提取一般使用CTAB法，雖然可以避免多酚類物質的影響，卻存在提取時間長、提取步驟繁瑣、相關藥劑毒性強等缺點，而堿煮法提取雖然避免了CTAB法相關問題，卻又存在葉片內多酚類物質無法去除的缺點，導致后續進行瓜類作物育種改良、品種純度分子標記鑒定等等相關實驗時，DNA質量無法滿足相關需求。

發明內容

本發明的目的在于提供一種工藝步驟簡單、易于操作且組織需求小、提取質量高的快速提取瓜類基因組DNA的方法，以滿足后續進行的瓜類作物育種改良、品種純度分子標記鑒定等相關項目對瓜類基因組DNA的需要。

其技術方案是：一種快速提取瓜類基因組DNA的方法，其特征在于按下述步驟依次操作：

（1）瓜類植物組織選取：

選取2-2.5mm³瓜類植物的幼嫩部位組織；

（2）基因組DNA的提取：

將選取的瓜類植物組織放置于96孔PCR板的底部，堿煮法提取基因組DNA；

（3）基因組DNA的沉淀：

將堿煮后的96孔PCR板置于離心機進行離心后，依次提取其每孔內的上清液并移至另外一個96孔PCR板的各孔內，各孔內再加入50-100μL的異丙醇，置于-20℃冰箱內冰凍保存；

（4）基因組DNA的重溶：

將步驟（3）沉淀基因組DNA的96孔PCR板置于離心機進行離心后，吸出每孔內的上清液舍棄；沉淀加入75%乙醇40μL，靜置2min，吸出乙醇舍棄；沉淀加入95%乙醇40μL，靜置2min，吸出乙醇舍棄；將96孔PCR板倒置于桌面30min，加入100μL的TE緩沖液，即得純化基因組DNA。

其有益效果是：本發明在堿煮法提取植物組織基因組DNA方法的基礎上，加入異丙醇沉淀基因組DNA，由于瓜類植物中的多酚類物質不受異丙醇沉淀，依舊溶解在上清液中，故通過舍棄上清液和基因組DNA重溶的方法，大幅度提高了提取瓜類植物基因組DNA的質量，從而滿足了后續進行的瓜類作物育種改良、品種純度分子標記鑒定等相關項目對瓜類基因組DNA的需要；同時，本方法工藝步驟簡單、易于操作且組織需求小，特別適合對瓜類基因組DNA大批量的提取。

附圖說明

圖1為堿煮法提取的無籽一號基因組DNA和純化后無籽一號基因組DNA進行PCR擴增后結果對比。圖中A系列條帶擴增模板是堿煮法提取的無籽一號基因組DNA，B系列擴增模板是純化后無籽一號基因組DNA，圖中1-12編號分別代表無籽一號不同單株。

具體實施方式

實施例1。一種快速提取西瓜品種無籽一號基因組DNA的方法，按下述步驟依次操作：

（1）植物組織選取：

選取2-2.5mm³室內沙床播種的西瓜無籽一號銅錢大小的幼嫩葉片組織；

（2）基因組DNA的提取：

將選取的葉片組織放置于96孔PCR板的底部，每孔加入40μL0.70mol/L的NaOH溶液，在沸水浴1min，然后加入30μL0.70mol/L的Tris-HCI，100℃沸水浴1min；

（3）基因組DNA的沉淀：