[發明專利]快速獲取鵝鐵蛋白重鏈基因編碼區序列及定量檢測其表達的方法及其引物

無效

• 申請號: 201310303514.X
• 申請日: 2013-07-19
• 公開（公告）號: CN103409408A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 康波;姜冬梅;白林;王迅;趙玲;王林杰;王艷;何琿;馬容
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68;C12N15/11
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技術領域

本發明涉及的是一種快速獲取鵝鐵蛋白重鏈基因編碼區序列及定量檢測其表達的方法及其引物。

背景技術

鐵元素是細胞生長、增殖及維持生物機體機能活動所必需的微量元素之一，在細胞DNA合成、電子傳遞、氧氣運輸等過程中發揮重要作用。但是，如果鐵超載可以潛在誘導氧自由基的生成，導致細胞損傷。因此，細胞鐵穩態的維持和調節成為目前鐵代謝研究方面的中心環節。鐵蛋白（Ferritin）是一種保守性較高的多功能、多亞基蛋白，在維持細胞內鐵穩態過程中發揮著雙重作用：一方面如果細胞中鐵含量增多，鐵蛋白會螯合細胞質中的游離鐵，細胞內過多的鐵被封閉起來，細胞內鐵的穩態得以維持，保護細胞免受游離金屬的毒性作用；另一方如果當外源鐵不足時，被鐵蛋白存儲的鐵可以釋放出來以供細胞利用。鐵蛋白及其受體對于調控鐵攝取、貯存以及維持細胞內正常鐵濃度具有重要作用。鐵蛋白含有重鏈亞基（ferrintin?heavy?chain,?FTH）和輕鏈亞基（ferritin?light?chain,?FTL），FTH負責結合Fe²⁺，催化鐵氧化；FTL與鐵的長期貯藏有關。研究表明，產蛋期鵝卵巢和肝臟組織FTH的表達水平均顯著高于產蛋前期，提示FTH可能對鵝卵巢發育和功能具有重要的調控作用。然而，目前有關鵝FTH基因的結構和功能仍不清楚。

目前用于克隆較長目的基因的常用方法主要包括分段克隆和快速擴增cDNA末端技術（Rapid?Amplification?of?cDNA?Ends,?RACE）。分段克隆以目的基因保守區設計多對引物，每對引物所擴增的目的基因片段有重疊，然后將所有分段的片段進行克隆、測序、拼接，獲得完整的目的片段。最后再以拼接序列為模板設計一對引物來驗證所獲得的基因是否為目的基因。RACE技術是基于PCR技術基礎之上，分別在cDNA序列的3’末端和5’末端設計特定引物，然后進行克隆，從而獲得cDNA全長序列的方法。總之，分段克隆和RACE技術都需要做許多次PCR和克隆工作，操作過程繁瑣，工作量大，耗時長，且成本高。

半定量反轉錄－聚合酶鏈式反應（Semi-Quantitative?Reverse?Transcriptase?Polymerase?Chain?Reaction,?SQRT-PCR）是指將mRNA反轉錄成cDNA，再進行PCR擴增，取等量的PCR產物，在同一塊瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，然后通過比較電泳圖中目的基因和內參基因條帶的光密度值計算目的基因表達量（或拷貝數）的定量檢測技術。SQRT-PCR技術采用的PCR反應終點法。因此，現有方法只能在PCR反應結束時，獲得目的基因片段拷貝數，不能全程了解定量過程中的變化。由于受到半定量電泳操作的影響、凝膠成像系統和光密度分析的分辨率和準確性的限制，定量結果會出現較大偏差和誤差，不能十分準確的檢測目的基因表達量。

實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-time?Quantitative?Reverse?Transcriptase?Polymerase?Chain?Reaction，?QRT-PCR）是指在PCR反應體系中加入熒光染料（如SYBR?Green），隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，這個熒光染料所發出的信號也會隨之發生變化，每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度的變化來監測產物量的變化，從而可以實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。QRT-PCR技術可以對整個PCR反應進行全程實時監測，因此具有結果可靠、準確性高等優點。

因此，為闡明鵝FTH基因的結構和功能，揭示鵝機體內鐵代謝的分子調控機制，提高鐵代謝相關研究的效率，降低研究成本、提高結果可靠性和準確性，建立簡便、快速獲取鵝FTH全長編碼區序列及定量檢測FTH基因表達的方法具有重要意義。

發明內容

本發明的目的之一在于針對上述技術不足提供一種快速獲取鵝FTH基因編碼區序列的方法，該方法操作簡便、成本低、效率高。

為實現上述目的，本發明的技術方案為。