[發明專利]人乳頭瘤病毒核酸檢測方法和試劑盒

無效

• 申請號: 201310303335.6
• 申請日: 2013-07-19
• 公開（公告）號: CN104293974A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 浦艷
• 申請（專利權）人: 浦艷
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明涉及一種用于診斷人乳頭瘤病毒(HPV)感染的檢測方法，以及利用該方法制成的試劑盒檢測患者體內分離出的DNA樣本中HPV基因型以診斷其是否屬于所述24個型中的某一型。屬于生命科學和技術領域。?

背景技術：

由于感染HPV是引起子宮頸癌的一大原因，所以現在這一研究已成為子宮頸癌預防的前沿學科。在西方工業化國家，對于所有的惡性腫瘤疾病，子宮頸癌也許是公共預防措施做得最好的例子。?

子宮頸癌是婦女中最常見的惡性腫瘤，主要發生于多產婦女的早期絕經期。每年全世界有約19萬人死于子宮頸癌，而其中超過3/4的死亡發生在發展中國家。子宮頸癌的發生率在所有癌癥中排名第七，而在婦女中排名第三，僅次于乳腺癌和大腸癌。在發展中國家，少于50％的患子宮頸癌的婦女能存活5年以上，而在發達國家，5年存活率是66％左右。?

在過去的10年中，估計全世界每年有將近371000例新的侵入性子宮頸癌，占到整個婦女癌癥的10％。子宮頸癌高發病區主要位于中南美洲、南非、東非和加勒比地區，這些地區每年的平均發病率達到萬分之四。東歐和北美的發病率低于每年萬分之三，但在巴西東北部，發病率要比北美高10倍，一生中累積風險性可高達10％。?

現有子宮頸癌的篩查技術可分兩類，基于形態學的方法是在細胞或組織水平檢查以識別不正常，基于分子生物學的方法是檢查子宮頸上皮瘤的子宮頸癌的標志物。進一步區分這些方法可根據他們釋放借助于顯微鏡或物理和電光學的特性。表1總結了當前各種子宮頸癌篩查的方法，而其中最關聯或最有先兆的方法總結在如下幾節。?

Pap細胞學：Pap檢測是最早的癌癥檢測方法之一，毫無疑問，它同時也是現代醫學中最有成效的一種方法。Pap檢測主要是檢查子宮頸癌先兆，通過重復檢測，可以密切監測可疑的或低度異常，或提議病人立即進行陰道鏡、細胞切片檢查，并對高度或嚴重的損害進行治療。通過Pap檢測預防侵入性子宮頸癌，可在它還只是上皮組織時就阻止其惡性發展。?

薄層液相為基礎的細胞學：ThinPrepTM和Autocyte?Prep系統是兩種基于液體的用于代替傳統Pap涂片的制片方法。從子宮頸取得的樣本被溶于細胞保存液而不是直接涂在玻璃片上。通過這種方法幾乎所有的細胞都可給予檢測。在傳統Pap涂片法中，約20％從子宮頸收集的細胞會被置于玻璃片上，而在薄層樣本中，多余的血細胞和炎癥細胞會被裂解，而含有?約50000細胞的隨機樣本會由自動細胞處理機轉移到玻璃片，并形成一薄層涂片，這涂片經染色后由細胞技術員進行檢查。這種自動的薄層技術可以使涂片更清晰、均一，并且沒有血細胞、炎癥細胞碎片和細胞集落這些影響顯微鏡檢測的因子，從而提高對非典型細胞、癌癥先兆和癌癥的檢出率。?

自動化細胞學：自動化的系統正處于測試和市場推廣的階段。這些系統包括一種能自動把子宮頸癌細胞懸浮液制成標準薄層玻璃片的裝置，及通過計算機輔助掃描來首先發現不正常細胞，并把這些涂片分離處理以便作進一步的人工細胞學檢測。這些方法最關鍵的優點是可減輕因缺乏合格的細胞學家而引起的人員緊張。現在在北美和歐洲，有許多私人公司贊助的比較性實驗正在驗證這些自動化機器的篩查效率和經濟效益。?

醋酸法目視篩查(VIA)：在低收入國家，目查法已成為一種技術要求低、能代替細胞學篩查的方法。這些目查法包括直接檢查子宮頸，借助醋酸的目查法(也稱為直接目查DVI,子宮鏡和輔助目查)，低倍鏡醋酸目查(VIAM)，Lugol’s碘酒目查法(VILI)和子宮頸圖像。?

篩查中檢查HPV：目前研究人員正在比較HPV檢測與Pap檢測作為子宮頸癌篩查方法的優缺點。由于HPV難以進行體外培養，而且不是所有的感染者都有可檢測的抗體反應。因此，HPVDNA的檢測是非介入式檢測HPV感染最好方法。目前HPV檢測的方法主要有三類：?

第一類是直接探針結合，如southern印跡和點印跡，原位雜交過濾法等。這些方法普遍存在靈敏度低，操作繁瑣等缺點。?

第二類是信號放大法，大多數的研究所采用的是唯一經FDA批準的Digene的第一和第二代Hybrid?Capture(HC)系統。另一些用不同的PCR方法來檢測HPV。相比于HC法，PCR的檢測靈敏度更高，但第二代HC2的檢測靈敏度已大大提高，接近于PCR的水平。HC2檢查是通過微孔板化學發光信號擴增的核酸雜交技術，定性檢查子宮頸樣本中高危HPV病毒，這些病毒通常與子宮頸癌有聯系，它們是：16、18、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68。?