[發明專利]用于制備Col17-IgG1Fc融合蛋白的細胞系及其應用

在審

• 申請號: 201310303122.3
• 申請日: 2013-07-18
• 公開（公告）號: CN104293735A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 王明悅;彭洋;王佩茹;陳天成;陳喜雪;朱學駿
• 申請（專利權）人: 北京大學第一醫院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12P21/00;C07K19/00;C12N15/62;A61K38/16;A61P37/02;A61P17/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種用于制備Col17-IgG1Fc融合蛋白的細胞系及其應用。

背景技術

大皰性類天皰瘡（Bullous?pemphigoid，BP）是最常見的皮膚自身免疫性表皮下大皰病，主要發生在老年人。臨床表現以皮膚出現瘙癢性紅斑、張力性的水皰和大皰為特征，黏膜損害較少見。重癥患者可出現嚴重的水電解質紊亂、低蛋白血癥、感染甚至發生敗血癥，可危及生命。目前該病的一線治療是系統應用糖皮質激素和/或免疫抑制劑，長期使用可能導致感染、血栓、骨質疏松、糖尿病、高血壓、消化道潰瘍穿孔出血等，嚴重威脅患者的健康和生命。近年來逐漸推廣的米諾環素與煙酰胺聯合療法可明顯降低治療副作用，但仍有相當數量的病人對上述常規治療不敏感，或者出現無明顯誘因的復發。分析既往治療手段在療效和副作用方面的缺陷，很大程度與其治療靶點不特異有關；未針對BP發病的最關鍵環節進行干預。故借助于對BP發病機制深入研究，篩選其中的關鍵環節作為特異性治療靶點，可能研制出更為高效、低毒的治療藥物。

近年來以生物制劑為代表的特異性靶向治療發展迅速，為解決目前BP治療中所存在的不足提供了新的思路。由于體液免疫介導了BP的主要發病過程，B細胞合成致病性自身抗體是BP的關鍵發病環節，故利用以B細胞為攻擊靶點的藥物——利妥昔單抗（Rituximab）殺傷B細胞，可阻斷自身抗體的產生，從而達到治療BP的目的。利妥昔單抗是基因重組合成的抗CD20單克隆抗體，能夠特異地結合B細胞表面特異性抗原CD20，其Fc段與NK細胞、細胞毒性T細胞、巨噬細胞等細胞表面的Fc受體結合，可以誘導抗體依賴細胞介導的細胞毒效應（ADCC），同時通過抗體Fc段激活補體依賴的細胞毒效應（CDC），從而達到殺傷B細胞的功效。多個病例回顧研究已經報道了利用利妥昔單抗治療BP的成功經驗。這種靶向治療的療效和特異性都較之前明顯提高。但是，非特異地殺傷所有B細胞會導致機體在一定時間內完全缺乏B細胞，增加了嚴重感染的風險。B細胞的完全清除和重建還可能使病人的B細胞免疫記憶受損。部分病人對該種治療無效或出現復發，提示產生自身抗體的病理性B細胞可能并未被完全清除。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于制備Col17-IgG1Fc融合蛋白的細胞系及其應用。

本發明提供了一種COL17NC16A-IgG1Fc質粒穩定轉染的293T細胞系BPKU，簡稱細胞系BPKU，已于2013年06月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號），其保藏編號為CGMCC?No.7801。

本發明還保護細胞系BPKU在制備Col17-IgG1Fc融合蛋白中的應用；所述Col17-IgG1Fc融合蛋白為由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質。

本發明還保護一種制備所述Col17-IgG1Fc融合蛋白的方法，包括如下步驟：培養細胞系BPKU并收集培養上清，即為含有所述Col17-IgG1Fc融合蛋白的溶液。培養所述細胞系時可以采用DMEM不完全培養基。所述方法還可包括如下步驟：取所述培養上清，12000rpm離心10min，收集上清液并加入50kD超濾離心管中，4℃、4000g離心15min，得到含有所述Col17-IgG1Fc融合蛋白的蛋白濃縮液。

本發明還保護細胞系BPKU在制備用于治療大皰性類天皰瘡的藥物中的應用。

本發明還保護一種用于治療大皰性類天皰瘡的藥物，其活性成分為以上所述方法制備得到的Col17-IgG1Fc融合蛋白。

本發明還保護所述Col17-IgG1Fc融合蛋白在制備用于治療大皰性類天皰瘡的藥物中的應用。

本發明還保護一種用于治療大皰性類天皰瘡的藥物，其活性成分為所述Col17-IgG1Fc融合蛋白。

本發明還保護所述Col17-IgG1Fc融合蛋白以及編碼所述Col17-IgG1Fc融合蛋白的基因。所述基因具體可如序列表的序列2所示。

現有的大皰性類天皰瘡治療藥物利妥昔單抗不能區分COL17NC16A特異性B細胞，對所有B細胞均具有殺傷作用，所以副作用較大。Col17-IgG1Fc融合蛋白具有特異性殺傷大皰性類天皰瘡患者體內的COL17NC16A特異性B細胞的作用，可以避免殺傷其它B細胞，副作用極低。本發明提供的細胞系BPKU，具有高效生產Col17-IgG1Fc融合蛋白的性能。本發明對于大皰性類天皰瘡的治療具有重大價值。

附圖說明