[發明專利]一種新喋呤納米磁微?；瘜W發光免疫定量檢測試劑盒及其制備方法

有效

• 申請號: 201310303105.X
• 申請日: 2013-07-18
• 公開（公告）號: CN103364559A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 劉萍;欒大偉;李克錦
• 申請（專利權）人: 博奧賽斯（天津）生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N21/76;G01N33/531
• 代理公司: 天津濱?？凭曋R產權代理有限公司 12211
• 代理人: 韓敏

技術領域

本發明涉及免疫分析醫學領域，具體的，本發明提供了一種新喋呤（NPT）納米磁微?；瘜W發光免疫定量檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術

新喋呤(neopterin,NPT)是人體體液中最重要的一種喋啶類物質，化學名為2-胺基-4羥基-6-(D-赤蘚糖基1,2,3,三羥基丙基)喋呤，它是三磷酸鳥苷(GTP)代謝衍生的低分子化合物、四氫生物喋呤生物合成過程中的一種中間代謝產物。是一種由IFN-γ刺激巨噬細胞而產生的喋啶化合物。新喋呤是細胞介導免疫激活的敏感標志，其濃度增加見于與細胞介導免疫激活有關的疾病，新喋呤的檢測主要應用在腫瘤、創傷、免疫系統疾病、內分泌系統疾病、消化系統疾病、循環系統疾病、感染及器官移植等臨床檢測上。

目前，臨床領域應用的新喋呤檢測方法主要是酶聯免疫測定法。酶聯免疫測定法具備操作簡單、價格低廉，精密度高，特異性好，準確性良好，是一種較好的微量物質檢測技術，但敏感性相對較低，板間差異大，測值重復性較差，所用標記酶與底物可定量測定范圍窄，及儀器測定范圍窄等缺點。

化學發光免疫測定其研究起步于80年代初，快速發展應用于90年代，為當今最為敏感的微量免疫測定法。

發明內容

本發明要解決的問題是提供新喋呤的化學發光免疫定量檢測試劑盒及其制備方法，避免了測值重復性差，酶聯免疫法靈敏度低，檢測范圍窄等缺陷。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：新喋呤（NPT）納米磁微粒化學發光免疫定量檢測試劑盒，包括：新喋呤校準品；偶聯有鏈霉親和素的納米磁微粒懸浮液；生物素標記的新喋呤抗體；新喋呤抗體酶結合物，所用的酶為辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶純度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；新喋呤質控品，質控品包括濃度3nmoL/L的低值質控品和200nmoL/L的高值質控品；化學發光液A液和B液，A液為5mmol/L，pH8.6的Tris-HCl緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度0.7g/L魯米諾和終濃度0.165g/L對碘酚；B液為0.675g/L過氧化脲；20倍濃縮洗液；反應管。

進一步，所述的納米磁微粒是表面包裹帶有氨基或羧基活性基團的四氧化三鐵，粒徑10-50nm。

進一步，所述的反應管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

（1）新喋呤校準品的配制：

將新喋呤純品用校準品稀釋液稀釋至工作濃度，分別為0，1，5，20，80，250nmoL/L；所述校準品稀釋液為含1%BSA的磷酸鹽緩沖液；

（2）新喋呤質控品的配制：

用校準品稀釋液將新喋呤純品稀釋至3nmoL/L和200nmoL/L，3nmoL/L作為低值質控品，200nmoL/L作為高值質控品；

（3）納米磁微粒-鏈霉親和素懸浮液的制備：

A、四氧化三鐵納米磁微粒制備

采用沉淀法制備四氧化三鐵納米磁微粒，具體制備方法如下：1）將FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O以摩爾比2：1加入到蒸餾水中，劇烈攪拌溶解；2）在氮氣環境下加0.5M氨水于上述鐵鹽溶液中，調pH9-10，反應溫度65℃，反應時間45min；3）反應結束后，用蒸餾水洗滌至中性，棄上清，于60℃烘干，即得10-50nm的四氧化三鐵納米磁微粒；

B、納米磁珠表面羧基的偶聯

采用分散聚合法進行偶聯，具體制備方法如下：取上述制備的納米磁微粒超聲分散在10%PEG8000溶液中，得磁流體溶液，向磁流體溶液中按體積比1：10加入無水乙醇，攪拌30min后，移入帶有攪拌器，冷凝管，氮氣入口的三頸瓶中，加入交聯劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺；在氮氣的保護下，升溫至60±1℃，恒溫攪拌30min，之后依次加入磁流體體積3%的過氧化苯甲酰，攪拌速度約為500rpm，磁流體溶液相同體積的苯乙烯，磁流體溶液體積25%的丙烯酸，保持氮氣氣流,其余條件保持不變,反應8-10h，所得產物靜置，用蒸餾水反復洗滌，再用鹽酸調節pH=1，浸泡24h，靜置；再用蒸餾水反復洗滌，除去未包覆的Fe₃O₄磁粉，把沉淀下來的產品放入真空干燥箱中50℃下干燥24h，得到表面聯有羧基的納米磁微粒；

C、納米磁微粒-鏈霉親和素懸浮液的制備，配制1L，方法如下：