[發(fā)明專(zhuān)利]一種混合干細(xì)胞注射劑及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310302780.0
• 申請(qǐng)日: 2013-07-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103330720A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏偉;嵐山芮;許超
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣州市天河諾亞生物工程有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): A61K35/44
• 分類(lèi)號(hào): A61K35/44;A61P35/02;A61P37/06;A61P37/02;A61P39/00;A61K35/14
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 黃磊

1.一種混合干細(xì)胞注射劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)：將臍帶去掉外層羊膜和剔除血管，去除殘余血液，留取沃頓膠質(zhì)，將沃頓膠質(zhì)剪成1mm²的組織塊，平鋪在T25培養(yǎng)瓶底，加入MSC無(wú)血清培養(yǎng)基，置于37℃，飽和濕度，濃度5%的CO₂條件下培養(yǎng)6～8天，細(xì)胞進(jìn)行換液繼續(xù)培養(yǎng)；

（2）間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代：步驟（1）換液培養(yǎng)3-4天后細(xì)胞進(jìn)行傳代，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰酶消化1分鐘，MSC無(wú)血清培養(yǎng)基終止消化，500g離心去上清，留取細(xì)胞沉淀，用MSC無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，接種在T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，按1：3的比例傳代，三天傳代一次，取第3代間充質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞共培養(yǎng)；

（3）臍血造血干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：新鮮臍血經(jīng)Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞，收集細(xì)胞沉淀，用含有EDTA和人血清白蛋白的PBS緩沖液再洗一次，離心力200g，離心時(shí)間10分鐘；離心完后，收集細(xì)胞沉淀，用30ml含有EDTA和人血清白蛋白的PBS緩沖液重懸，MiniMACS免疫磁珠分選法從單個(gè)核細(xì)胞中純化出高表達(dá)CD34+的造血干細(xì)胞；分選出的CD34+造血干細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞按照15：1的數(shù)量比，同時(shí)接種在T75培養(yǎng)瓶中，根據(jù)得到的CD34+造血干細(xì)胞的數(shù)量來(lái)確定加入特定培養(yǎng)基的體積，確保CD34+造血干細(xì)胞接種密度為5×10⁴個(gè)/ml，間充質(zhì)干細(xì)胞接種數(shù)量6×10⁴個(gè)；每個(gè)T75培養(yǎng)瓶加入特定培養(yǎng)基的體積不得超過(guò)30ml；然后加入特定培養(yǎng)基，放置在37℃，二氧化碳濃度5%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第6天，分別收集懸浮生長(zhǎng)的造血干/祖細(xì)胞和貼壁生長(zhǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，造血干/祖細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞按照50：1的數(shù)量比同時(shí)接種在T175培養(yǎng)瓶中，根據(jù)擴(kuò)增后的造血干/祖細(xì)胞的數(shù)量來(lái)確定加入特定培養(yǎng)基的體積，確保造血干/祖細(xì)胞密度為1×10⁶個(gè)/ml，間充質(zhì)干細(xì)胞接種數(shù)量2×10⁶個(gè)，每個(gè)T175培養(yǎng)瓶加入特定培養(yǎng)基的體積不得超過(guò)50ml；然后加入特定培養(yǎng)基，放置在37℃，二氧化碳濃度為5%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)4天后收獲細(xì)胞；

（4）將步驟（3）制備的造血干/祖細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞加入含有體積分?jǐn)?shù)為5%AB臍血漿的生理鹽水定容至兩種干細(xì)胞的濃度分別為5×10⁵/ml和2×10⁵/ml，制成混合干細(xì)胞注射劑。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合干細(xì)胞注射劑的制備方法，其特征在于：步驟（1）中所述的臍帶為無(wú)菌采取健康人的臍帶。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合干細(xì)胞注射劑的制備方法，其特征在于：步驟（1）和（2）中所述的MSC無(wú)血清培養(yǎng)基為L(zhǎng)onza公司的TheraPEAK^TMMSCGM-CD^TMMedium。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合干細(xì)胞注射劑的制備方法，其特征在于：步驟（3）中所述的新鮮臍血為從臍血采集到制備不應(yīng)超過(guò)4小時(shí)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合干細(xì)胞注射劑的制備方法，其特征在于：步驟（3）中所述的新鮮臍血經(jīng)Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞的條件為新鮮臍血與生理鹽水體積比1：2稀釋后，經(jīng)Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，離心時(shí)間25min，離心力500g，離心加速度為7，減速度為2；溫度20℃，離心結(jié)束后，取白膜層；加入3倍體積的生理鹽水，洗滌一次，離心力600g，離心10min，收集細(xì)胞沉淀。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合干細(xì)胞注射劑的制備方法，其特征在于：步驟（3）中所述的含有EDTA和人血清白蛋白的PBS緩沖液為美天旎公司的CliniMACS?PBS/EDTA?Buffer。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合干細(xì)胞注射劑的制備方法，其特征在于：步驟（3）中所述的MiniMACS免疫磁珠分選法：經(jīng)兩次過(guò)LS分選柱，分選出的CD34+造血干細(xì)胞的純度達(dá)到90%以上。