[發明專利]高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體及其制備方法

有效

• 申請號: 201310302778.3
• 申請日: 2013-07-18
• 公開（公告）號: CN103320406A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 魏景艷;宋健;郭笑
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08;C12N15/70;C12N15/85
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 張景林;王恩遠

1.一種高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體，其氨基酸序列如SEQ?ID?No:1所示。

2.如權利要求1所述的一種高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體，其特征在于：將SEQ?ID?No:1所示的氨基酸序列中任何一個或多個的丙氨酸Ala突變為絲氨酸Ser所形成的谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體。

3.如權利要求2所述的一種高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體，其特征在于：所形成的突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?No:2所示。

4.如權利要求1所述的一種高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體，其特征在于：SEQ?ID?No:1所示的氨基酸序列中第2、78、115、156和202位的5個絲氨酸中的一個或多個被硒代半胱氨酸取代所形成的谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體。

5.如權利要求4所述的一種高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體，其特征在于：所形成的突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?No:3所示。

6.一種高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體，其氨基酸序列如SEQ?ID?No:4、SEQ?ID?No:5或SEQ?ID?No:6所示。

7.權利要求1所述的高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體的制備方法，其步驟如下：

1）、表達載體的構建：

根據氨基酸序列SEQ?ID?No:1，用DNA合成儀人工合成能在營養缺陷型菌株中表達GPX1突變體蛋白的基因，確保靶基因的5′端含有起始密碼子ATG，3′端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點，確保靶基因的49位硒代半胱氨酸SeCys的編碼序列替換為半胱氨酸Cys的密碼子，且基因全長不含有ACA序列；然后用相同的限制性核酸內切酶切割兩端含特定酶切位點的GPX1突變體基因和分泌型原核表達載體，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX1突變體基因組裝到分泌型原核表達載體上；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而GPX1突變體基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列；

2）、陽性轉化子的篩選及蛋白的表達與純化：

用步驟1）中構建的含有GPX1突變體基因的表達載體轉化營養缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受態細胞，涂含Cys的營養瓊脂平板，篩選陽性菌株；再將含有表達核酸內切酶MazF的pMazF質粒轉化陽性菌株，用含雙抗性的M9固體培養基篩選陽性轉化子；將陽性轉化子擴培養后，在含有SeCys、必需生長因子和營養素的培養基里，經IPTG低溫4-25℃誘導表達，營養缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，直接表達出在底物GSH的結合部位含有SeCys的GPX1突變體，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質腔里，而MazF能通過識別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質的表達；先小量培養篩選高表達株，再擴大培養和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX1突變體蛋白，透析凍干后即得GPX1突變體蛋白純品，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE和蛋白印跡Western?blot鑒定目標蛋白；

或，

1）、表達載體的構建：

根據GPX1的基因序列設計引物，擴增其編碼基因，在設計引物時，確?；虻?′端含有起始密碼子ATG，3′端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點，確保第2和202位Cys的密碼子替換成Ser的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限制性核酸內切酶切割載體和靶基因后，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX1基因組裝到分泌型原核表達載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據GPX1中要突變為半胱氨酸的49位硒代半胱氨酸和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長25-50bp，用定點突變引物和快速定點突變試劑盒，將構建在原核表達載體上的GPX1基因中的硒代半胱氨酸的編碼序列突變成半胱氨酸的密碼子；同理，用上述定點突變的方法在確保不引入ACA序列的前提下，將GPX1基因中的其它半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子；再根據密碼子的簡并性，在不改變氨基酸序列的前提下，將GPX1基因中所有ACA序列突變掉；通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生，確保突變后的基因能在營養缺陷型菌株中表達本發明所述的GPX1突變體蛋白；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列；

2）陽性轉化子的篩選及突變體蛋白的表達與純化

用步驟1）中構建的含有GPX1突變體基因的表達載體轉化營養缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受態細胞，涂含半胱氨酸的營養瓊脂平板，篩選陽性菌株；再將表達核酸內切酶MazF的質粒pMazF轉化陽性菌株，用含雙抗性的M9固體培養基篩選陽性轉化子；將陽性轉化子擴培養后，在含有硒代半胱氨酸、必需生長因子和營養素的培養基里，經異丙基硫代-β-D-半乳糖苷低溫4-25℃誘導表達，營養缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用半胱氨酸的密碼子合成硒代半胱氨酸，直接表達出在底物谷胱甘肽的結合部位含有硒代半胱氨酸的重組GPX1突變體，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質腔里，而MazF能通過識別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質的表達；先小量培養篩選高表達株，再擴大培養和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得含GPX1突變體的上清液；用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX，透析凍干后即得酶蛋白純品；

或，

1）、表達載體的構建：

根據氨基酸序列SEQ?ID?No:1，用DNA合成儀人工合成能在營養缺陷型菌株中表達GPX1突變體蛋白的基因，確保靶基因的5′端含有起始密碼子ATG，3′端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點，確保靶基因的49位硒代半胱氨酸SeCys的編碼序列替換為半胱氨酸Cys的密碼子；用相同的限制性核酸內切酶切割兩端含特定酶切位點的GPX1突變體基因和分泌型原核表達載體，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX1突變體基因組裝到分泌型原核表達載體上；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有而GPX1突變體基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列；

2）、陽性轉化子的篩選及蛋白的表達與純化：

用步驟1）中構建的含有GPX1突變體基因的表達載體轉化營養缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受態細胞，涂含Cys的營養瓊脂平板，篩選陽性轉化子；將陽性轉化子擴培養后，在含有SeCys、必需生長因子和營養素的培養基里，經異丙基硫代-β-D-半乳糖苷IPTG誘導，營養缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，最后直接表達出在底物GSH的結合部位含有SeCys的GPX1突變體蛋白，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質腔里；先小量培養篩選高表達株，再擴大培養和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX1突變體蛋白，透析凍干后即得GPX1突變體蛋白純品；

或，

1）、表達載體的構建：

根據GPX1的基因序列設計引物，擴增其編碼基因，在設計引物時，確?；虻?′端含有起始密碼子ATG，3′端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點，確保第2和202位Cys的密碼子替換成Ser的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限制性核酸內切酶切割載體和靶基因后，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX1基因組裝到分泌型原核表達載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據GPX1中要突變為半胱氨酸Cys的49位SeCys和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長25-50bp；用定點突變引物和快速定點突變試劑盒，將構建在原核表達載體上的GPX1基因中的SeCys的編碼序列突變成Cys的密碼子；同理，用上述定點突變的方法將GPX1基因中的其它半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子；通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生，確保突變后的基因能在營養缺陷型菌株中表達本發明所述的GPX1突變體蛋白；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列；

2）、陽性轉化子的篩選及蛋白的表達與純化：

用步驟1）中構建的含有GPX1突變體基因的表達載體轉化營養缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受態細胞，涂含Cys的營養瓊脂平板，篩選陽性轉化子；將陽性轉化子擴培養后，在含有SeCys、必需生長因子和營養素的培養基里，經異丙基硫代-β-D-半乳糖苷IPTG誘導，營養缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，最后直接表達出在底物GSH的結合部位含有SeCys的GPX1突變體蛋白，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質腔里；先小量培養篩選高表達株，再擴大培養和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX1突變體蛋白，透析凍干后即得GPX1突變體蛋白純品；

或，

1）、表達載體的構建：

根據氨基酸序列SEQ?ID?No:1，用DNA合成儀人工合成GPX1突變體蛋白的基因，確?；虻?′端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點，3′端在終止密碼子下游引入GPX1基因的3′端非翻譯區的全部堿基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS和特定的酶切位點；用相同的限制性核酸內切酶切割兩端含特定酶切位點的GPX1突變體基因和哺乳類細胞表達載體，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX1突變體基因連同其3′端非翻譯區的全部堿基序列或硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；根據硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白SBP2羧基端343-854位的512個氨基酸的基因序列，用DNA合成儀人工合成其編碼基因，確?；虻?′端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點，3′端含有終止密碼子和特定的酶切位點，用特定的酶切位點將SBP2基因組裝到胞內型哺乳類細胞表達載體上；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列；

2）、陽性細胞株的篩選：

用含有SBP2和GPX1突變體基因的載體在轉染試劑的介導下共轉染哺乳類細胞，用兩個載體上的抗性基因通過抗生素濃度從高到低逐級遞減法篩選兼具兩種抗性的陽性細胞克隆，再用多孔培養板逐級放大培養陽性克隆，最終獲得同時穩定表達SBP2和GPX1突變體兩種外源蛋白的陽性細胞株；檢測GPX1突變體蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株；

3）、靶蛋白的表達與純化：

在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養，在含有亞硒酸鈉的培養基里用哺乳類細胞表達GPX1突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養基里，用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX1突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品；

或，

1）、表達載體的構建：

根據的GPX1突變體的氨基酸序列SEQ?ID?NO:1用DNA合成儀人工合成GPX1突變體的編碼基因，確保基因的5′端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點，3′端在終止密碼子下游引入GPX1基因的3′端非翻譯區的全部堿基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS和特定的酶切位點；用相同的限制性核酸內切酶切割兩端含特定酶切位點的GPX1突變體基因和哺乳類細胞表達載體，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX1突變體基因連同其3′端非翻譯區或硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；根據硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白SBP2羧基端343-854位的512個氨基酸的基因序列，用DNA合成儀人工合成其編碼基因，確?；虻?′端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點，3′端含有終止密碼子和特定的酶切位點，用特定的酶切位點將SBP2基因組裝到胞內型哺乳類細胞表達載體上；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列；

2）、陽性細胞株的篩選：

先用含有SBP2基因的載體轉染哺乳類細胞，通過該載體上的抗性基因篩選穩定表達SBP2的細胞株；再用含有GPX1突變體基因的載體轉染穩定表達SBP2的細胞株，用兩個載體上的抗性基因篩選同時穩定表達SBP2和GPX1突變體兩種外源蛋白的細胞株；檢測GPX1突變體蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株；

3）、靶蛋白的表達與純化：

在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養，在含有亞硒酸鈉的培養基里用哺乳類細胞表達GPX1突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養基里；用谷胱甘肽親和層析純化GPX1突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品；

或，

1）、表達載體的構建：

根據GPX1基因序列，設計引物擴增GPX1的編碼基因及其3′端非翻譯區的堿基序列，在設計引物時，確保靶基因的5′端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點，靶基因的3′端在終止密碼子下游引入GPX1基因的3′端非翻譯區的全部堿基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS和特定的酶切位點，確保第2位Cys的密碼子替換成Ser的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限制性核酸內切酶切割兩端有特定酶切位點的靶基因和哺乳類細胞表達載體，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX1基因連同其3′端非翻譯區組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據GPX1中要突變為絲氨酸的半胱氨酸和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長25-50bp，用定點突變引物和快速定點突變試劑盒，將構建在真核表達載體上的GPX1基因中的全部半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子；通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生，確保突變后的基因能編碼本發明所述的GPX1突變體蛋白；根據硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白SBP2羧基端343-854位的512個氨基酸的基因序列，設計引物擴增其編碼基因，確?；虻?′端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點，3′端含有終止密碼子和特定的酶切位點；同樣經酶切連接后用特定的酶切位點將SBP2基因組裝到胞內型哺乳類細胞表達載體上；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列；

2）、陽性細胞株的篩選：

用含有SBP2和GPX1突變體基因的載體在轉染試劑的介導下共轉染哺乳類細胞，用兩個載體上的抗性基因通過抗生素濃度從高到低逐級遞減法篩選兼具兩種抗性的陽性細胞克隆，再用多孔培養板逐級放大培養陽性克隆，最終獲得同時穩定表達SBP2和GPX1突變體兩種外源蛋白的陽性細胞株；檢測GPX1突變體蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株；

3）、靶蛋白的表達與純化：

在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養，在含有亞硒酸鈉的培養基里用哺乳類細胞表達GPX1突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養基里，用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPX1突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品；

或，

1）、表達載體的構建：

根據GPX1基因序列設計引物擴增GPX1的編碼基因及其3′端非翻譯區的堿基序列，在設計引物時，確保靶基因的5′端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點，靶基因的3′端在終止密碼子下游引入GPX1基因的3′端非翻譯區的全部堿基序列或硒代半胱氨酸插入序列SECIS和特定的酶切位點，確保第2位Cys的密碼子替換成Ser的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限制性核酸內切酶切割兩端有特定酶切位點的靶基因和哺乳類細胞表達載體，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPX1基因連同其3′端非翻譯區組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據GPX1中要突變為絲氨酸的半胱氨酸和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長25-50bp，用定點突變引物和快速定點突變試劑盒，將構建在真核表達載體上的GPX1基因中的全部半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子；通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生，確保突變后的基因能夠編碼本發明所述的GPX1突變體蛋白；根據硒代半胱氨酸插入序列結合蛋白SBP2羧基端343-854位的512個氨基酸的基因序列，設計引物擴增其編碼基因，確?；虻?′端含有起始密碼子ATG和特定的酶切位點，3′端含有終止密碼子和特定的酶切位點；同樣經酶切連接后用特定的酶切位點將SBP2基因組裝到胞內型哺乳類細胞表達載體上；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的DNA序列；

2）、陽性細胞株的篩選：

先用含有SBP2基因的載體轉染哺乳類細胞，通過該載體上的抗性基因篩選穩定表達SBP2的細胞株；再用含有GPX1突變體基因的載體轉染穩定表達SBP2的細胞株，用兩個載體上的抗性基因篩選同時穩定表達SBP2和GPX1突變體兩種外源蛋白的細胞株；檢測GPX1突變體蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株；

3）、靶蛋白的表達與純化：

在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養，在含有亞硒酸鈉的培養基里用哺乳類細胞表達GPX1突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養基里；用谷胱甘肽親和層析純化GPX1突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品。