[發明專利]熱休克蛋白70作為免疫佐劑的應用

無效

• 申請號: 201310302666.8
• 申請日: 2013-07-15
• 公開（公告）號: CN103405763A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 孫黎;張健
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: A61K39/39
• 分類號: A61K39/39;A61P37/04
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體的說是一種熱休克蛋白70作為免疫佐劑的應用。

背景技術

熱休克蛋白70(Heat?shock?protein70,Hsp70)，是一類分子量約70kD的熱休克蛋白，也是目前發現的主要分子伴侶蛋白之一。Hsp70對調節蛋白內環境的穩定具有重要作用，可維持細胞蛋白自穩，提高細胞對應激原的耐受性，使細胞維持正常的生理功能。研究表明，Hsp70不僅參與細胞正常的生長、發育和分化，而且與細胞和機體的免疫有關。病原體和宿主細胞產生的Hsp70大多有共同的抗原決定簇，從而可以增強宿主細胞的體液和細胞免疫反應。另外，作為一種分子伴侶，Hsp70還可以通過與抗原的相互作用，從而促進抗原向MHCI分子的轉運。

發明內容

本發明目的在于提供一種熱休克蛋白70作為免疫佐劑的應用。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種熱休克蛋白70作為免疫佐劑的應用。

進一步的說，所述大菱鲆熱休克蛋白70作為免疫佐劑的應用。

將所述熱休克蛋白70表達的質粒與DNA疫苗質粒分別在PBS中稀釋至400ug/ml，稀釋后按1:1比例混合，待用。

所述熱休克蛋白70表達的質粒是以大菱鲆cDNA為模板，用引物F1和R1進行PCR擴增，PCR產物與載體pEASY-E2連接，獲得質粒pEASY-Hsp70；用限制性內切酶EcoRV酶切pEASY-Hsp70后回收2kb片段，與質粒pCN3連接，得質粒pSmHsp70。

本發明具有如下優點：Hsp70可作為增強肽或多糖免疫佐劑，本發明的熱休克蛋白70能夠顯著提高DNA疫苗的免疫保護效應。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例旨在對本發明進行舉例描述，而非以任何形式對本發明進行限制。

在本發明實施例中所涉及到的常規性實驗方法均采用如下方法：

1.質粒提取、DNA(PCR)產物純化、DNA片段從凝膠中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相應試劑盒。

2.大腸桿菌用Hanahan方法（Sambrook?and?Russell:Molecular?Cloning:A?Laboratory?Mannual.Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press?2001）。

3.所有限制性內切酶和連接酶皆購自于“紐英倫生物技術有限公司”，北京。

實施例1

熱休克蛋白70表達質粒pSmHsp70的構建：

本發明的熱休克蛋白70的序列已公開（GenBank?accession?No.ABP04033.1）。以大菱鲆cDNA為模板，用引物F1和R1進行PCR擴增。PCR條件為：94℃60s預變性模板DNA,然后94℃40s,58℃60s,72℃60s,5個循環后改為94℃40s,65℃60s,72℃60s,30個循環后再在72℃延伸反應7－10min。PCR產物用天根的相應試劑盒純化。PCR產物用T4DNA連接酶與載體pEASY-E2(購于TransGen?Biotech,北京)在室溫連接2－4小時，連接液轉化入大腸桿菌DH5α，在含氨芐青霉素（100ug/ml）的LB培養基上培養18－24小時,篩選轉化子提取質粒，即為質粒pEASY-Hsp70。用限制性內切酶EcoRV酶切pEASY-Hsp70后回收2kb片段；將質粒pCN3（構建過程參見Jiao?XD,Zhang?M,Hu?YH,Sun?L.Construction?and?evaluation?of?DNA?vaccines?encoding?Edwardsiella?tarda?antigens.Vaccine2009;27:5195–202.）用EcoRV酶切,回收5.4kb片段。將上述兩片段用T4DNA在室溫連接2－4小時，連接液轉化入大腸桿菌DH5α，在含卡那霉素（50ug/ml）的LB培養基上培養18－24小時,篩選轉化子提取質粒，命名為pSmHsp70。通過DNA測序分析證明了pSmHsp70為含有熱休克蛋白70序列的表達質粒。

所述LB組成成分按重量百分比計：1.0%蛋白胨,0.5%酵母粉,1.0%氯化鈉,97.5％蒸餾水。所述F1為5’-GATATCGCCACCATGTCTAAGGGACCAGCTG-3’；R1為5’-GCGCGATATCGTCCACCTCCTCAATGGT-3’。

實施例2